【摘要】 目的：研究去骨瓣減壓術對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后腦水腫、水孔蛋白-4（AQP-4）表達的影響。方法：應用改良Feeney’s自由落體腦損傷打擊裝置制成大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型，分為假手術組（SO組）、對照組（C組）及去骨瓣減壓組（DC組），各組在損傷后再分為6、12、24、72、120 h及168 h等6個時間點斷頭取腦損傷區(qū)組織。分別利用干濕重量法測量腦組織含水量和Western-Blot檢測AQP-4蛋白的表達。結果：大鼠去骨瓣減壓組腦組織含水量及AQP-4蛋白表達呈現先升高后降低的趨勢，于傷后24 h達高峰后逐漸下降。與C組相比，上述指標含量均有所下降：腦組織含水量在24、120、168 h差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），72 h差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；AQP-4蛋白表達在12、120 h時間點有統(tǒng)計學意義（P<0.05），24、168 h時有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結論：創(chuàng)傷后大鼠腦組織腦水腫與AQP-4表達上調密切相關；去骨瓣減壓術可減輕腦水腫，減緩AQP-4表達。該手術對創(chuàng)傷性腦損傷的保護機制可能與減緩AQP-4蛋白表達，從而減輕腦水腫和繼發(fā)性腦損傷，保護腦組織有關。

【關鍵詞】 去骨瓣減壓； 水孔蛋白-4； 創(chuàng)傷性顱腦損傷； 創(chuàng)傷性腦水腫

隨著社會經濟的不斷發(fā)展，交通與工傷事故所致的顱腦創(chuàng)傷有逐年增多的趨勢，現已成為國內外1個致殘致死的主要原因。近年來，國內外許多臨床研究表明標準外傷去大骨瓣減壓術能降低顱內高壓患者的致殘率及死亡率，但較高的致殘率以及部分患者療效欠佳也引起臨床的重視。一系列關于去骨瓣減壓術的基礎實驗研究近年來也在陸續(xù)開展，目的在于研究顱內高壓去骨瓣減壓術后腦循環(huán)腦代謝的變化。但國內外從分子水平上探討去大骨瓣減壓術的腦保護機制的研究卻很少。近年來發(fā)現AQP-4是廣泛分布于腦組織的一種與水通透相關的細胞膜轉運蛋白，對腦組織水的轉運和平衡調節(jié)發(fā)揮重要作用，與腦水腫有著密切關系。本研究就是通過建立創(chuàng)傷性腦損傷動物模型，探討AQP-4在創(chuàng)傷性腦水腫的發(fā)生、發(fā)展中的作用；并結合去骨瓣減壓術，探討去大骨瓣減壓術對創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）保護作用的可能機制，從而為創(chuàng)傷性腦水腫的臨床治療尋求新的治療靶點和途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級成年雄性SD大鼠，體重250～350 g，由汕頭大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。隨機分為假手術組（sham operation group，簡稱SO組，18只鉆孔，不打擊），對照組（control group，簡稱C組，36只，鉆孔后只打擊，不減壓）和去骨瓣減壓組（decompressive craniotomy group，簡稱DC組，36只，鉆孔打擊后行去大骨瓣減壓術）。各組再分損傷后6 h、12 h、24 h、72 h、120 h和168 h等6個時間點，每個時間點6只大鼠（假手術組每個時間點3只）。

1.2 主要試劑 兔抗鼠AQP-4單克隆抗體（Sigma公司）；羊抗兔抗體（Sigma公司）；PVDF膜（PALL公司）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 腦損傷模型的建立 采用改良Feeney’s自由落體腦損傷裝置制成大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型[1]。實驗大鼠經10%水合氯醛0.3 ml/100 mg腹腔注射麻醉后，俯臥位固定，頭頂正中稍偏右縱行切開頭皮約2.5 cm，剝離骨膜，暴露右頂骨，用微型顱鉆在冠狀縫后1.5 mm，中線旁2.0 mm處鉆一直徑5.0 mm骨窗，保持硬膜完整。將撞擊圓錐置于硬膜上，用40 g砝碼于25 cm高處沿空心導管墜落，通過撞擊圓錐間接撞擊硬膜，致右頂葉重型腦挫裂傷，打擊后計時。C組大鼠止血后骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮；DC組鉆孔打擊后同時行去大骨瓣減壓術，形成大小約0.8 cm×1.0 cm減壓骨窗，放射狀剪開硬膜，止血后縫合顳肌、頭皮；SO組僅鉆孔，不打擊。各組在6個相應時間點快速斷頭取損傷處腦組織，每只大鼠損傷邊緣處腦組織分為兩部分，分別用來測定腦組織含水量，AQP-4蛋白表達。

1.3.2 腦組織含水量測定 取損傷區(qū)左緣腦組織（200±20）mg，

分析天平稱濕重后置于100 ℃恒溫干燥箱內干燥48 h至恒重，稱干重后按Elliot公式計算腦組織含水量：腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3.3 Western-Blot法檢測腦組織AQP-4蛋白表達 取損傷區(qū)后緣腦組織（50±20）mg，加入裂解液剪碎組織并置于冰上勻漿機上勻漿，4℃下12 000 r/min離心5 min后，利用紫外分光光度計檢測總蛋白濃度。取上清液加入SDS加樣緩沖液，煮沸5 min離心后-20℃保存。取總蛋白為等量的各個樣本在5%～12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠在100 V電壓下電泳60 min，取下膠板與PVDF膜置于濾紙與海綿之間，在恒流150 mA下進行轉膜1.5 h，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，加入一抗兔抗鼠AQP-4單克隆抗體（A5971：1：1000稀釋），4 ℃孵育過夜，然后再與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（A0545：1：10000稀釋）室溫孵育2 h，ECL化學發(fā)光顯影定影。選用β-actin作為內參照，圖像用Quantity one軟件進行處理分析，測定各組分別與內參照β-actin條帶灰度值的比值，其比值的變化可以反應AQP-4蛋白的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數據進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組腦損傷大鼠腦組織含水量比較 打擊后大鼠傷側腦組織含水量于傷后6 h明顯升高，傷后24 h達高峰，之后呈逐漸下降趨勢。SO組腦組織含水量穩(wěn)定在相對較低水平，C組相對較高，與SO組比較，6、12、24、72、120 h差異均有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；DC組腦組織含水量處于兩者之間，與SO組比較，6、12、120 h差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），24、72 h差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），168 h 差異無統(tǒng)計學意義；DC組腦組織含水量與C組比較，24、120、168 h差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），72 h差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表1。

2.2 三組腦損傷大鼠腦組織AQP-4蛋白含量比較 AQP-4條帶灰度值與內參照β-actin條帶灰度值之比代表AQP-4蛋白的表達水平。損傷后6 h腦組織的AQP-4蛋白表達開始上調，12 h依次增高，24 h達到高峰，之后逐漸下降。其變化規(guī)律與腦組織含水量變化規(guī)律基本一致。C組與SO組比較，差異在每個時間點均有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。DC組與SO組比較，在6 h時差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），在12、24、72、120 h 時差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。DC組與C組相比，在12、120、168 h時差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），在24 h時差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖1、2及表2。

3 討論

TBI在世界范圍內都是致死致殘的重要原因，而創(chuàng)傷性腦水腫是TBI最嚴重的并發(fā)癥之一。一般認為，TBI導致的創(chuàng)傷性腦水腫包括兩種類型腦水腫：細胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫。近來大多數研究認為細胞毒性腦水腫在創(chuàng)傷性腦水腫中占主導作用[2-4]，而不是血管源性腦水腫。目前對創(chuàng)傷性腦水腫的治療主要手段為脫水療法及手術干預。去大骨瓣減壓術在國內外臨床應用已30余年，但是其療效及機制仍未確切。目前國內外對去骨瓣減壓術對腦損傷保護作用的基礎研究正在逐步開展。Zweckberger等[5]人在動物TBI模型中證實：去骨瓣減壓術能降低TBI引起的顱內高壓，明顯減輕了繼發(fā)性腦損傷及顯著改善神經功能。另有研究表明，去骨瓣減壓術可增加減壓區(qū)腦血流灌注，尤其是缺血半暗區(qū)的血流[6]。Forsting等[7]人在大鼠腦缺血模型中研究亦證實：去骨瓣減壓術通過增加缺血區(qū)腦灌注壓，從而減少死亡率，有效改善預后和減少梗死面積。也有學者認為，腦血流量增加意味著大量的血管內物質可通過已破壞的BBB滲透到腦組織內[8]，滲透壓梯度增加，血管內水分依滲透壓梯度滲出到腦組織內，從而加重腦水腫。另外，去骨瓣減壓可降低顱內（ICP），使腦組織與腦血管之間的液體靜壓梯度增加，促進腦水腫形成[9]。但是大多數學者認為，顱內高壓去骨瓣減壓術能有效降低ICP，腦挫傷缺血半暗區(qū)腦血流量增加可使瀕臨缺血組織免受進一步缺血和壞死，阻斷或減輕細胞毒性腦水腫進一步發(fā)展和范圍擴大。而且，去骨瓣減壓術后有可能會使靜脈引流變得更加通暢，從而促進水腫液回流，加快腦水腫消退。去骨瓣減壓術增加了半暗區(qū)腦血流量，改善缺血區(qū)微循環(huán)，同時也使該區(qū)域的血管本身得到血供，使血管內皮細胞免受進一步的缺血性損害，減少細胞毒性腦水腫的生成；而且，如果足夠早期行去骨瓣減壓術，腦血流早期得到供應恢復，則很有可能避免長期顱高壓損害下導致的繼發(fā)性腦損傷，包括繼發(fā)性腦水腫的形成。避免大量自體有害物質產生對實質細胞、血腦屏障的破壞，并且血流的回流的通暢可促進有害物質的排出，進一步減輕腦損害。

本實驗中利用大鼠改良自由落體腦損傷裝置，成功制造創(chuàng)傷性腦損傷模型，模擬臨床上的重型顱腦損傷。TBI導致的腦損傷的主要病理變化是缺血缺氧性改變。本實驗結果顯示：TBI的早期，C組和DC組腦組織含水量呈逐漸升高趨勢，在24 h時達高峰后逐漸下降，在168 h內仍高于假手術組，而AQP-4蛋白的表達強度與腦組織含水量變化趨勢基本一致，這一結果與Sun等[10]的研究結論基本一致，他們認為，AQP-4的表達上調是引起損傷區(qū)腦水腫的主要途徑和原因。筆者在實驗中還觀察到，DC組與C組同一時間點比較，腦組織含水量、AQP-4蛋白表達均有明顯下降。在腦組織含水量中，在24 h、120 h、168 h時間點時均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），在72 h時有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在腦內AQP-4蛋白表達方面，在12 h、120 h時有統(tǒng)計學意義（P<0.05），在24 h、168 h時有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。因此筆者認為，在大鼠TBI中，損傷區(qū)通過腦組織AQP-4急劇增高，從而導致腦水腫的生成，進一步促使顱內高壓形成。而去骨瓣減壓術可通過減低去骨瓣區(qū)顱內壓，減少AQP-4蛋白表達，從而進一步減少腦水腫的生成，保護腦組織。

總之，去骨瓣減壓術可減緩TBI后腦組織AQP-4蛋白表達，減輕腦水腫的程度，但具體機制未完全明了。目前推測去骨瓣減壓術可能通過減壓區(qū)腦血流灌注，使瀕臨死亡的細胞獲得足夠的能量，減少有害因子的釋放，阻斷炎癥因子的級聯反應，從而減輕了細胞毒性腦水腫；另外可能是通過減少炎癥因子的生成，減緩了腦組織內AQP-4的表達的增加，降低了BBB通透性，從而減輕了血管源性腦水腫的進一步發(fā)展及范圍擴大。但是AQP-4在創(chuàng)傷性腦水腫的具體作用機制在本實驗中未探討，有待進一步研究。

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（收稿日期：2013-07-17） （本文編輯：蔡元元）