【摘要】 目的：探討體外感染減毒麻疹病毒（MV）對子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞（JEC）的凋亡誘導(dǎo)作用及相關(guān)機(jī)理。方法：MTT比色法動(dòng)態(tài)監(jiān)測MV感染對JEC細(xì)胞增殖活力的影響；瓊脂糖凝膠電泳以及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測MV感染后JEC細(xì)胞的Fas、FasL及TGF-β表達(dá)，分析凋亡機(jī)制。結(jié)果：MV感染6 d內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞的生長；感染6 d后，抑制細(xì)胞的生長，最終造成細(xì)胞死亡。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：各感染濃度組JEC細(xì)胞的凋亡率比正常對照組增高（P<0.05或P<0.01），隨感染時(shí)間的延長，細(xì)胞的凋亡率呈上升的趨勢，感染12 d時(shí)，凋亡率與感染濃度呈正相關(guān)（r=0.77），且瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)特征性DNA“Ladder”凋亡條帶；此時(shí)，感染細(xì)胞內(nèi)Fas及TGF-β的表達(dá)增強(qiáng)（P<0.01），而FasL始終未表達(dá)。結(jié)論：MV感染能夠抑制JEC細(xì)胞增值，并誘導(dǎo)其凋亡，JEC細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與Fas、TGF-β的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 減毒麻疹病毒； 子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； Fas； FasL； TGF-β

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，以來源于內(nèi)膜腺體的腺癌最常見。為女性生殖道三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%。近年來發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢。早期患者預(yù)后較好，而晚期患者多有盆腔外轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，雖然采用手術(shù)、放射、藥物等綜合治療，但5年生存率仍較低，因此尋找新的治療方法迫在眉睫 [1]。溶瘤病毒治療是近年來興起的一種新的腫瘤治療途徑，其機(jī)制在于利用基因工程對病毒進(jìn)行改造，使其在腫瘤中選擇性復(fù)制并產(chǎn)生溶瘤作用[2]。病毒溶瘤結(jié)合其他治療，使得腫瘤治療的療效顯著提高，得到我國政府的重視，不斷加大投入，相繼啟動(dòng)了一些與溶瘤病毒學(xué)密切相關(guān)的重大研究項(xiàng)目。麻疹病毒（MV）感染可誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡，利用MV這一感染特性，有研究人員開展了利用MV治療淋巴瘤、腦腫瘤、卵巢癌等的研究，并獲得了較好的療效[3-7]。尤其是利用基因重組的MV-CEA、MV-NIS（MV與放射性碘化鈉的重組體）治療卵巢癌的方法已用于一期臨床試驗(yàn)[6-7]。JEC是一株人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系，研究證實(shí)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞表面表達(dá)麻疹病毒結(jié)合受體CD46[8]。因此設(shè)想麻疹病毒是否對子宮內(nèi)膜腺癌有抑制作用；其抑制作用是否通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)？因此，本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度的MV感染JEC細(xì)胞，然后觀察不同感染濃度及時(shí)間細(xì)胞的增值及凋亡情況，并對病毒感染前后細(xì)胞Fas、FasL、TGF-β的表達(dá)進(jìn)行測定，初步探討MV對JEC的抑制作用及其相關(guān)機(jī)理，為利用MV對子宮內(nèi)膜癌進(jìn)行溶瘤治療的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 麻疹病毒疫苗京160（北京天壇生物制品股份有限公司）；JEC細(xì)胞（遵義醫(yī)學(xué)院微生物教研室）；Annexin-v FITC/PI試劑盒（晶美生物工程公司）；兔抗Fas、兔抗FasL、兔抗TGF-β（Santa Cruz公司）；小量凋亡DNA抽提試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病毒感染濃度的選定 TCID50測定按照中國生物制品規(guī)程操作，對病毒進(jìn)行倍比稀釋，接種JEC細(xì)胞，每個(gè)稀釋度設(shè)4復(fù)孔，并設(shè)空白對照，置37 ℃、相對濕度97%、5% CO2孵箱中連續(xù)培養(yǎng)，觀察7 d，以第7天感染細(xì)胞出現(xiàn)2孔或2孔以上多核巨細(xì)胞病變的病毒的最高稀釋度作為病毒效價(jià)。

1.2.2 MTT檢測 用96孔板接種細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁伸展生長后，MV感染細(xì)胞，每個(gè)稀釋度設(shè)6復(fù)孔，并設(shè)正常對照。感染后第1～10天分別進(jìn)行MTT檢測。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 按DNA提取試劑盒說明書提取經(jīng)病毒感染12 d（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果）的JEC細(xì)胞DNA，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，條件為60 V，4 h，然后使用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測電泳結(jié)果并拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù) 于病毒感染后一定時(shí)間收集細(xì)胞，按Annexin-V FITC/PI試劑盒說明書進(jìn)行操作，制備樣品，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞凋亡機(jī)理 收集MV感染后12 d的細(xì)胞，進(jìn)行石蠟包埋、切片，進(jìn)行切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞Fas、FasL以及TGF-β的表達(dá)變化，進(jìn)行吸光度值的比較。設(shè)陰性對照、正常對照、病毒組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩變量的相關(guān)性以相關(guān)系數(shù)（r）值確定，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒TCID50 病毒TCID50的稀釋度為1：160，本研究擬采用1：80、1：40、1：20、1：10四個(gè)稀釋度作為感染濃度。

2.2 MTT檢測 抑制率=1-（病毒組OD/正常對照組OD），見表1。每個(gè)稀釋度設(shè)6復(fù)孔，同一感染濃度條件下，病毒感染時(shí)間與抑制率呈正相關(guān)（P<0.01）。感染后6 d內(nèi)，病毒對細(xì)胞的生長表現(xiàn)為促進(jìn)作用；而6 d后，開始出現(xiàn)抑制作用，同一感染濃度，各濃度組不同感染天數(shù)的組間均存在著差異（P<0.05或P<0.01），9、10 d抑制率與感染濃度呈正相關(guān)

2.3 凋亡特征性 DNA “Ladder”條帶的形成在1：10、1：20、1：40稀釋度出現(xiàn)了凋亡特征性的“Ladder”條帶，而對照組無明顯的DNA“Ladder”條帶的出現(xiàn)，見圖1。

圖1 MV感染后JEC細(xì)胞DNA電泳結(jié)果

注：M：marker；1：陰性對照；2～4：1：10、1：20、1：40稀釋度感染12 d

2.4 流式細(xì)胞儀檢測JEC凋亡率的結(jié)果 每個(gè)稀釋度設(shè)3復(fù)瓶培養(yǎng)，同一感染濃度條件下，隨感染時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率逐漸上升，兩者為正相關(guān)。同一時(shí)間點(diǎn)與對照組比較，病毒組的細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05或P<0.01），感染后12 d，感染濃度與凋亡率呈正相關(guān)，見表2。

2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測JEC細(xì)胞Fas、FasL以及TGF-β表達(dá)結(jié)果

2.5.1 Fas的表達(dá) 鏡下Fas陽性染色主要位于細(xì)胞漿中，每組取8個(gè)不同視野進(jìn)行光密度值測定，與正常對照組相比，病毒組Fas陽性反應(yīng)強(qiáng)度增加，染色變深；正常對照組與陰性對照組相比，染色變深。經(jīng)圖像分析系統(tǒng)軟件分析各組的平均吸光度值，結(jié)果顯示與陰性對照組相比，正常對照、病毒組的平均光密度值降低。各組間比較差異顯著（P<0.01），見表3。

2.5.2 FasL的表達(dá) 每組取8個(gè)不同視野進(jìn)行光密度值測定，鏡下觀察FasL在陰性對照組、正常對照組、病毒感染組中均無表達(dá)。比較各組平均光密度值，各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.5.3 TGF-β的表達(dá) 每組取8個(gè)不同視野進(jìn)行光密度值測定，鏡下陰性對照組、正常對照組均不表達(dá)，病毒組陽性染色主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)軟件分析各組的平均光密度值。結(jié)果顯示：與陰性對照組比較，正常對照組光密度值降低不明顯，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；病毒組與上述兩組相比平均光密度降低，組間比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3 討論

MV為單股負(fù)鏈RNA病毒，H、F和N（核蛋白）三種蛋白是麻疹病毒的主要抗原成分，MV通過CD46、SLAM（淋巴活化信號分子）、DC-SIGN（C-血凝素細(xì)胞間粘附分子）受體介導(dǎo)病毒的感染及傳播，CD46是麻疹疫苗株和麻疹病毒實(shí)驗(yàn)室株的主要細(xì)胞受體[9-12]。SLAM在有活性的T 和B細(xì)胞表面上表達(dá)，是新發(fā)現(xiàn)的麻疹病毒細(xì)胞受體[13]。麻疹野生病毒、實(shí)驗(yàn)室株和麻疹疫苗株都能在有表達(dá)SLAM的細(xì)胞上產(chǎn)生典型的病變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此MV在人類腫瘤的溶瘤治療中具有廣泛的應(yīng)用前景，其抗瘤譜包括多種淋巴、非淋巴人類惡性腫瘤。在婦科腫瘤中，國外已經(jīng)將基因改造的MV應(yīng)用于卵巢癌的I期臨床試驗(yàn)[6-7]。國內(nèi)亦有研究證實(shí)麻疹減毒活疫苗體外可抑制原代卵巢癌細(xì)胞生長，引起細(xì)胞病變和細(xì)胞凋亡，另有研究顯示MV減毒株在組織培養(yǎng)中和裸鼠體內(nèi)對HeLa人宮頸癌腫瘤有明顯的殺傷作用，因此減毒MV疫苗株在婦科腫瘤中有很好的應(yīng)用前景[14-15]。本研究將減毒麻疹疫苗感染人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞，感染后6 d，亦表現(xiàn)為抑制細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞凋亡率與病毒的感染時(shí)間及感染濃度有關(guān)，由此，筆者推測MV抑制細(xì)胞生長可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。但是，在病毒感染6 d內(nèi)，病毒對細(xì)胞的生長表現(xiàn)為促進(jìn)作用，病毒濃度越高，其促進(jìn)作用越強(qiáng)。推測其可能的原因是細(xì)胞感染早期，無細(xì)胞膜及線粒體膜的破裂，細(xì)胞相互融合，使線粒體的功能加強(qiáng)，還原MTT形成藍(lán)紫色的甲臢結(jié)晶增多，導(dǎo)致OD值升高；也可能是MV感染初期細(xì)胞分泌促生長物質(zhì)，使細(xì)胞生長加快。但這種推測，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明?？傊?，MV最終抑制JEC的生長，并誘導(dǎo)感染細(xì)胞的凋亡，可進(jìn)一步用于人子宮內(nèi)膜腺癌治療的實(shí)驗(yàn)研究。

通過MV感染DC細(xì)胞的研究證明，人類DC細(xì)胞的凋亡是通過Fas/FasL介導(dǎo)[16]。另外，MV可通過誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的外周血單核細(xì)胞（PBMC）Fas的表達(dá)，間接引起未感染MV但表達(dá)FasL的旁觀者T細(xì)胞凋亡[17]。TGF-β既能增強(qiáng)某些細(xì)胞的增殖、分化能力，又能誘導(dǎo)某些細(xì)胞的凋亡反應(yīng)，如TGF-β可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、子宮上皮細(xì)胞凋亡及猴免疫缺陷病毒感染所致的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的凋亡[18]。病毒感染可使TGF-β的表達(dá)增加，活性增強(qiáng)，促進(jìn)凋亡的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MV感染后12 d，各組細(xì)胞的凋亡率增至最高，并出現(xiàn)DNA Ladder凋亡條帶，此時(shí)病毒組Fas、TGF-β的表達(dá)均增加，而FasL在正常對照及病毒感染組始終未表達(dá)。提示MV誘導(dǎo)JEC凋亡的機(jī)制可能與Fas及TGF-β的表達(dá)有一定的關(guān)系，但FasL不表達(dá)的原因仍有待今后進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2013-07-15） （本文編輯：歐麗）