【摘要】 目的：利用RNA干擾技術(shù)（RNAi）下調(diào)肌腱細(xì)胞中V型膠原蛋白的表達(dá)，擬為后續(xù)探討V型膠原在損傷肌腱修復(fù)過(guò)程中的作用提供可行的試驗(yàn)方法。方法：分別設(shè)計(jì)干擾大鼠V型膠原[COL5（ 1）2（ 2）]兩個(gè)亞基COL5 1和COL5 2表達(dá)的siRNA序列，轉(zhuǎn)染大鼠肌腱細(xì)胞。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫熒光法檢測(cè)V型膠原在基因和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果：轉(zhuǎn)染特定的siRNA后，V型膠原兩個(gè)亞基的基因表達(dá)被抑制約70%，蛋白表達(dá)也被明顯抑制。結(jié)論：RNAi法可有效地抑制大鼠肌腱細(xì)胞中V型膠原的基因和蛋白水平表達(dá)。為進(jìn)一步研究V型膠原在肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中的作用提供了可行的試驗(yàn)方法。

【關(guān)鍵詞】 肌腱細(xì)胞； V型膠原； RNA干擾技術(shù)； 基因表達(dá)

年齡增長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)過(guò)度均可造成肌腱韌帶損傷。目前臨床上的治療方法主要是理療和手術(shù)縫合。由于肌腱韌帶內(nèi)細(xì)胞、血管較少，再生能力較差，所以愈后常由瘢痕組織修復(fù)，力學(xué)性能低下，易造成重復(fù)斷裂。

V型膠原在正常肌腱組織中含量很少，但在損傷肌腱中卻持續(xù)高表達(dá)52周[1]。有研究顯示過(guò)多的V型膠原抑制I型膠原的自聚生長(zhǎng)。培養(yǎng)抑制了V型膠原功能的纖維細(xì)胞（Ehlers-Danlos Syndrome），其所產(chǎn)生的Ⅰ型膠原纖維直徑大于正常膠原纖維[2]。損傷肌腱修復(fù)后膠原纖維直徑明顯變小，而這些小直徑纖維又與肌腱修復(fù)后力學(xué)性能低下相關(guān)[3-4]。所以降低V型膠原的表達(dá)可能有利于促進(jìn)大直徑膠原纖維的再生，提高損傷肌腱的修復(fù)效果。

RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）是近年興起的一種高效、特異阻斷靶mRNA表達(dá)而達(dá)到轉(zhuǎn)錄后基因沉默的新技術(shù)。能夠有效地抑制目的基因的表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)功能型缺失的現(xiàn)象，為研究特定基因功能提供良好的工具[5-6]。

本研究設(shè)計(jì)并合成干擾V型膠原兩個(gè)亞基的siRNA，轉(zhuǎn)染大鼠肌腱細(xì)胞，在基因和蛋白水平檢測(cè)抑制效率，篩選得到有效的干擾片段，為后續(xù)研究V型膠原的功能提供細(xì)胞水平平臺(tái)和可行的試驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 試劑 胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；siRNA分子（Ambion）、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑；mMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑（Invitrogen）、real time PCR試劑盒（TaKaRa）；V型膠原一抗（millpore）、熒光二抗。

1.2 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱；生物安全柜；倒置熒光電子顯微鏡（Olympus）；Real-Time PCR儀（ABI 7900 HT）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄不限，體重250 g左右。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取大鼠跟腱，剝離肌腱腱膜，將組織塊剪成勻漿狀，用混合膠原酶消化后，加入含10%FBS的DMEM，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下（標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境）進(jìn)行原代培養(yǎng)。4～5 d更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底約90%時(shí)，用胰蛋白酶消化按1：3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取P5以內(nèi)的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 siRNA序列設(shè)計(jì) 由Ambion公司設(shè)計(jì)與合成siRNA干擾序列。由于V型膠原的分子組成為COL5（ 1）2（ 2），所以分別設(shè)計(jì)了針對(duì)COL5 1和COL5 2亞基的siRNA序列，為實(shí)驗(yàn)序列，見(jiàn)表1。并提供已知有效抑制GAPDH的siRNA作為陽(yáng)性對(duì)照序列（positive control， PC），F(xiàn)AM綠色熒光標(biāo)記的亂序siRNA為陰性對(duì)照序列（negative control， NC）。

1.4.3 基因轉(zhuǎn)染 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠肌腱細(xì)胞按5×104/孔的密度接種于12孔板中，培養(yǎng)20 h后，更換無(wú)FBS的培養(yǎng)基后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體方法參照Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書。培養(yǎng)6 h后更換含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)基因干擾效率 肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染特定的siRNA48 h后，收集肌腱細(xì)胞，提取RNA，采用兩步法完成反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）（n=3）。采用b-actin做內(nèi)參，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（real time PCR）定量分析COL5 1和COL5 2基因的表達(dá)，所用引物見(jiàn)表2。

1.4.5 免疫熒光法檢測(cè)蛋白抑制效率 由于亂序的siRNA自身標(biāo)記FAM綠色熒光，不能用作陰性對(duì)照，所以用只加轉(zhuǎn)染試劑而不加任何siRNA的肌腱細(xì)胞作為對(duì)照組（Control）（n=3）。肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，去掉培養(yǎng)基，PBS潤(rùn)洗，固定，加入稀釋好的一抗，置于濕盒中4 ℃過(guò)夜（為扣除背景熒光，以不加一抗的肌腱細(xì)胞作為免疫熒光的方法學(xué)對(duì)照）。次日，PBS潤(rùn)洗，加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光1 h。再次用PBS潤(rùn)洗，熒光電子顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 體外培養(yǎng)肌腱細(xì)胞見(jiàn)圖1A。轉(zhuǎn)染特定的siRNA后，用熒光顯微鏡觀察陰性對(duì)照組肌腱細(xì)胞，結(jié)果見(jiàn)圖1B。肌腱細(xì)胞內(nèi)充滿綠色熒光，表明FAM標(biāo)記的siRNA進(jìn)入肌腱細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率較高。

注：體外培養(yǎng)大鼠肌腱細(xì)胞（圖1A）；轉(zhuǎn)染FAM熒光標(biāo)記siRNA的肌腱細(xì)胞（圖1B）

2.2 靶向siRNA抑制V型膠原在mRNA水平的表達(dá) 肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA48 h后，用real time PCR法檢測(cè)COL5 1和COL5 2在基因表達(dá)的水平，見(jiàn)圖2。與陰性對(duì)照組（亂序siRNA）相比， 1（V）實(shí)驗(yàn)組（siRNA196227）有效抑制了肌腱細(xì)胞中COL5 1基因水平的表達(dá)， 2（V）實(shí)驗(yàn)組（siRNA s136862）有效抑制了肌腱細(xì)胞中COL5 2基因水平的表達(dá)。抑制程度約70%左右（P<0.05）。陽(yáng)性對(duì)照組（抑制GAPDH的siRNA）有效抑制了GAPDH的表達(dá)（數(shù)據(jù)未展示）。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組目的為驗(yàn)證siRNA轉(zhuǎn)染方法的有效性，見(jiàn)圖2。

2.3 靶向siRNA抑制V型膠原在蛋白水平的表達(dá) 肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA72 h后，用免疫熒光法檢測(cè)肌腱細(xì)胞中V型膠原蛋白水平的表達(dá)，見(jiàn)圖3。 1（V）實(shí)驗(yàn)組（siRNA196227）有效抑制了肌腱細(xì)胞中Col5 1在蛋白水平的表達(dá)（圖3A）， 2（V）實(shí)驗(yàn)組（siRNAs136862）有效抑制了肌腱細(xì)胞中Col5 2在蛋白水平的表達(dá)（圖3E）。

注： 1（V）：實(shí)驗(yàn)組1（大鼠肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA196227）； 2（V）：實(shí)驗(yàn)組2（大鼠肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA s136862）；PC：陽(yáng)性對(duì)照（大鼠肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾GAPDH的siRNA）；NC：陰性對(duì)照（大鼠肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的亂序siRNA）（圖2A，圖2B）

注：V型膠原亞基Col5 1在蛋白水平的檢測(cè)（圖3A～3C）；V型膠原亞基Col5 2在蛋白水平的檢測(cè)（圖3D～3F）； 1（V）：實(shí)驗(yàn)組1（大鼠肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA196227）； 2（V）：實(shí)驗(yàn)組2（大鼠肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA s136862）；Control：空白對(duì)照組（大鼠肌腱細(xì)胞只加轉(zhuǎn)染試劑，不加任何siRNA）

3 討論

有研究表明損傷肌腱中V型膠原表達(dá)異常升高[1]，且過(guò)多的V型膠原抑制I型膠原的自聚生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)大鼠肌腱細(xì)胞，利用RNAi法抑制肌腱細(xì)胞中V型膠原兩個(gè)亞基COL5 1和COL5 2的表達(dá)。結(jié)果表明，化學(xué)合成的siRNA分子通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠肌腱細(xì)胞后，有效抑制了COL5 1和COL5 2在基因水平的表達(dá)，V型膠原在蛋白水平的表達(dá)也明顯降低。表明RNAi法可以有效抑制V型膠原在肌腱細(xì)胞中的表達(dá)。為后續(xù)研究V型膠原在肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用提供可行的試驗(yàn)方法。也為促進(jìn)損傷肌腱再生，達(dá)到結(jié)構(gòu)和功能的完全恢復(fù)帶來(lái)潛在的基因治療手段。

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（收稿日期：2013-05-20） （本文編輯：王宇）