摘要：基于多克隆抗體建立了氯噻啉的時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）方法。采用氯噻啉半抗原與卵清白蛋白（OVA）的偶聯(lián)物包被96 孔板為固相抗原，與樣品中游離的氯噻啉共同競(jìng)爭(zhēng)Eu3+標(biāo)記的抗氯噻啉抗體，用直接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)樣品中的氯噻啉，在水和土壤中分別添加氯噻啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，平均回收率為81.7%～103.8%，變異系數(shù)為3.9%～10%，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求，該TRFIA方法可用于環(huán)境與中氯噻啉殘留高靈敏度檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：氯噻啉 多克隆抗體 時(shí)間分辨免疫分析

中圖分類號(hào)：S482 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2013）24-0000-00

氯噻啉（imidaclothiz）是我國(guó)公司自主研發(fā)一種新煙堿類殺蟲劑，與常規(guī)殺蟲劑沒有交互抗性，因而可用于抗性治理，廣泛應(yīng)用于那些對(duì)有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、除蟲菊酯類已產(chǎn)生抗性的農(nóng)林業(yè)害蟲的防治[1]。由于其具有高效、廣譜、低毒等優(yōu)點(diǎn)，氯噻啉使用量日益上升，不合理的使用也經(jīng)常出現(xiàn)，對(duì)環(huán)境造成很大壓力，因此，研制快速廉價(jià)、靈敏度高、穩(wěn)定性好和篩通量大的檢測(cè)氯噻啉殘留的常規(guī)方法，加強(qiáng)對(duì)氯噻啉藥物的檢測(cè)和控制是一項(xiàng)刻不容緩的工作。

目前，有關(guān)氯噻啉殘留檢測(cè)方法主要是高效液相色譜法（HPLC）[2-4]。但前處理過程比較繁瑣，檢測(cè)結(jié)果受樣品凈化、濃縮等步驟的影響，不適合進(jìn)行批量樣品的快速檢測(cè)。而免疫分析技術(shù)具有很高的精確度、更靈敏的反應(yīng)，更強(qiáng)的特異性、不高的技術(shù)要求、更短的檢測(cè)時(shí)間和大批量測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的重視?？孤揉邕r(nóng)藥的多克隆抗體的酶聯(lián)免疫分析技術(shù)（ELISA）也有報(bào)道[5]，然而該方法檢測(cè)靈敏度不太理想。時(shí)間分辨免疫分析技術(shù)具有高靈敏性、高選擇性、快速等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)普通ELISA免疫分析技術(shù)靈敏度的不足。本研究建立了氯噻啉的TRFIA殘留檢測(cè)方法，為環(huán)境與食品中痕量氯噻啉殘留高靈敏檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

96孔聚苯乙烯熒光板（江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所）；95%氯噻啉原藥（南通江山農(nóng)藥化工股份有限公司）；卵清蛋白（OVA）、正三丁胺、氯甲酸異丁酯（Sigma公司）；Eu3+標(biāo)記盒為PerkinElmer公司產(chǎn)品；熒光增強(qiáng)液，（江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所）；碳酸鹽緩沖液（CBS）：0.05M，pH 9.6；磷酸鹽緩沖液（PBS）：0.01M，pH 7.4；氯噻啉多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)自行制備；二甲亞砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀等試劑均為分析純。

1.2包被原的合成

氯噻啉的半抗原合成參照文獻(xiàn)[5]，將合成的半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)通過混合酸酐法制備包被抗原。反應(yīng)液用PBS在4℃下透析3天。根據(jù)三者在280 nm的摩爾吸光系數(shù)（ε）估算半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比[10]：結(jié)合比=（ε偶聯(lián)物-ε載體蛋白）/ε半抗原。

1.3 包被板的制備

包被抗原用0.05 M pH 9.6 CBS溶液稀釋至5 μg /mL，加入到96孔微孔板中（100 μL /孔），4℃包被過夜，棄去包被液，加入封閉液，每孔200μL，37 ℃孵育2h，棄去封閉液，真空抽干，-20℃冷凍保存。

1.4 Eu3 + 標(biāo)記抗體的制備

取適量的PBS溶解的抗氯噻啉的抗體，在4℃下碳酸鹽緩沖液（0.05 M，PH 8.5）透析2次，每次24h，目的是除去溶液中NaN3并且轉(zhuǎn)換成碳酸鹽緩沖液。在碳酸鹽緩沖液環(huán)境中用DTTA-Eu3+標(biāo)記抗體。取0.5 mg上述透析的抗氯噻啉的抗體加入含0.2 mg 的DTTA- Eu3+的小瓶中，室溫下磁力攪拌反應(yīng)24 h。將Eu3 +標(biāo)記抗體溶液加入到Sephadex G-50層析柱中，用含0.9% NaCl的Tris-HCl洗脫液洗脫。收集層析柱流出液（ 1mL/管），逐管測(cè)量其吸光值（A280 nm），合并峰管。以Eu3+標(biāo)記試劑盒說明書提供的方法測(cè)定并計(jì)算抗體標(biāo)記率。

1.5 回收率的測(cè)定

河水經(jīng)過濾，添加不同濃度（0.05-0.5 mg/L）的氯噻啉標(biāo)樣，用含甲醇的PBS稀釋，直接用于TRFIA測(cè)定。稱取10g土壤，添加不同濃度（0.05-0.5 mg/kg）的氯噻啉標(biāo)樣，靜置一段時(shí)間，加入40mL二氯甲烷進(jìn)行超聲提取，4000 r/min離心。取上清液20 mL減壓濃縮，用含甲醇的PBS定容到10mL。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，各設(shè)一個(gè)空白對(duì)照，用建立的TRFIA法對(duì)樣品進(jìn)行分析。

1.6 分析測(cè)定

取準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板，加入50μL的氯噻啉標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品溶液到酶標(biāo)孔中，加Eu3 + 標(biāo)記抗氯噻啉抗體（50 mmol/L pH 7.4的PBS稀釋）100μL，室溫振蕩孵育30 min，用含0. 1% 吐溫-20的Tris-HCl（50 mmol /L pH 7.8）洗滌液洗6次。加200μL 增強(qiáng)液，振蕩孵育5 min 后，用熒光檢測(cè)儀進(jìn)行測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1包被原的鑒定

對(duì)氯噻啉半抗原、OVA及偶聯(lián)物進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)物的紫外吸收光譜具有載體蛋白和半抗原的紫外吸收特征，說明偶聯(lián)成功，如圖1所示。根據(jù)它們?cè)?80 nm波長(zhǎng)下的摩爾吸光系數(shù)估算得到包被原的結(jié)合比為8.5：1。

2.2 Eu3 +標(biāo)記率

Eu3+標(biāo)記抗體溶液經(jīng)Sephadex G-50層析，用離心管收集出現(xiàn)的第1洗脫峰，以PerkinElmer公司提供的Eu3+標(biāo)準(zhǔn)為參考，計(jì)算得出第1洗脫峰的Eu3+含量為22.4 μmol /L，蛋白質(zhì)含量為4.7 μmol /L，即平均每個(gè)免疫球蛋白分子上標(biāo)記了4.8個(gè)Eu3 +。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

各參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度以及熒光值建立氯噻啉的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為Y=-2.292X-3.0874， IC50為0.0447 mg/L，最低檢測(cè)限為0.005 mg/L。 圖2表明本試劑具有良好的劑量-反應(yīng)線性關(guān)系。

2.4 抗體的特異性

用TRFIA在相同的條件下測(cè)定氯噻啉和結(jié)構(gòu)類似煙堿類殺蟲劑對(duì)抗體的交叉反應(yīng)，計(jì)算各自的IC50和交叉反應(yīng)率CR（表1），結(jié)果表明得到的抗體對(duì)氯噻啉有較好的特異性，與大部分殺蟲劑的幾乎沒有交叉。

2.5 回收率測(cè)定

在河水和土壤中添加不同濃度的的氯噻啉標(biāo)樣，按照TRFIA進(jìn)行回收率測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果見表2。在水和土壤中分別添加氯噻啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，平均回收率為81.7%～103.8%，變異系數(shù)為3.9%～10%，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。

3 討論

本文基于多克隆抗體建立了氯噻啉TRFIA免疫分析方法。其靈敏度（IC50）較先前報(bào)道的ELISA[5]有了很大的提高（大約5倍），方法的抑制中濃度可達(dá)到0.0447 mg/L。可見TRFIA法檢測(cè)氯噻啉比ELISA 法靈敏度上具有明顯優(yōu)勢(shì)。時(shí)間分辨熒光免疫分析具有示蹤物穩(wěn)定、無放射性污染、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾、標(biāo)記物儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[6-9]，使得試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線飄移小，更提高了試劑的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。在研究抗體標(biāo)記和發(fā)光過程中發(fā)現(xiàn)：抗體的濃度與標(biāo)記效率和本底發(fā)光值成反比，高濃度標(biāo)記抗體，能夠提高靈敏度和降低本底，使我們建立方法所需要。本文建立的氯噻啉-TRFIA 法，與方松等人的報(bào)道在靈敏度上有了很大的提高，可以用于環(huán)境與食品中痕量氯噻啉的檢測(cè)需求。

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*通訊作者：洪霞，E-mail：hongxia19862@163.com

基金項(xiàng)目：江蘇省科技型企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金項(xiàng)目（BC2011188），江蘇省自然科學(xué)基金青年基金（BK2012274），鎮(zhèn)江市國(guó)際合作項(xiàng)目（GJ2012009），鎮(zhèn)江市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（NY2013006）。