摘要：本文主要利用快速檢測方法和傳統(tǒng)檢驗結(jié)合，對測量審核樣品進行檢測，從本次實驗可知傳統(tǒng)方法與儀器以及快速生化鑒定法結(jié)合運用，相互補充可提高檢測的準確性和效率。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌 杜邦BAX@Q7 PCR 生化鑒定 血清學鑒定

中圖分類號：R155 文獻標識碼：A 文章編號：1672-5336（2013）24-0000-00

沙門氏菌是一種可以引起沙門氏菌病廣泛分布在自然界的人畜共患的致病菌之一，是最常見的食源性致病菌，我國每年因沙門氏菌造成的食物中毒事件占全部食物中毒事件的40%～60%。沙門氏菌的血清型超過2000多種，且生化反應(yīng)復雜，傳統(tǒng)的方法全依靠人工檢測，大大增加了檢測難度。單純依靠傳統(tǒng)方法檢測，需要投入大量的人力物力，且耗時長，難以滿足目前形勢，在此需求下，快速、簡單、準確、特異性強的檢測方法應(yīng)運而生。

1 實驗

1.1 試劑和樣品

1.1.1 樣品

樣品來自遼寧出入境檢驗檢疫局的測量審核凍干粉樣品，編號為2012-MA-828。

1.1.2設(shè)備和試劑

冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、杜邦BAX@Q7：緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、木糖醇賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、HE瓊脂、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（環(huán)凱）、腦心浸出液肉湯（BHI）、三糖鐵（TSI）瓊脂、沙門氏菌生化鑒定試劑盒（環(huán)凱）、沙門氏菌診斷血清（寧波天潤）：

1.2實驗方法

1.2.1待測樣品的制備

無菌開啟西林瓶，立即加入少量稀釋液進行溶解，稀釋液合計40ml，先用少量稀釋液溶解樣品，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，反復用余下稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液放入上述無菌瓶中，此液即是待測樣品。

1.2.2沙門氏菌的檢測

（1）傳統(tǒng)方法檢測 （國標法GB 4789.4-2010）。吸取待測樣品25ml于225ml緩沖蛋白胨水（BPW）中，于36℃培養(yǎng)18～24h。取BPW增菌液1ml轉(zhuǎn)接到10mlTTB增菌液中，于42℃培養(yǎng)18～24h。另取BPW增菌液1ml轉(zhuǎn)接到10mlSC增菌液中，于36℃培養(yǎng)18～24h。從TTB增菌液中挑1環(huán)劃線分別接種到BS瓊脂平板和沙門氏顯色培養(yǎng)基中，于36℃培養(yǎng)40～48h；從SC增菌液中挑1環(huán)劃線分別接種到XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板和沙門氏顯色培養(yǎng)基中，于36℃培養(yǎng)18～24h。觀察所有平板是否有可疑菌落。

（2）杜邦BAX@Q7方法檢測。取按傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的BPW增菌液1ml到5mlBHI培養(yǎng)液中于36℃培養(yǎng)8～18h。另取傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的SC增菌液，同時用杜邦BAX@Q7檢測。樣品處理方法按照杜邦BAX@Q7檢測沙門氏菌試劑盒說明進行，根據(jù)所需要進行的反應(yīng)個數(shù)取適量的裂解液，按每ml裂解液中加入12.5μL蛋白酶比例添加蛋白酶試劑。充分混勻后，每管分裝200μL裂解液至裂解管中。分別加5μLBHI培養(yǎng)物和SC培養(yǎng)物到對應(yīng)的裂解管中，做好標記。將裂解管于37℃孵育20min后，再95℃裂解10min，最后在冷卻模塊上冷卻5min。吸取處理好的樣品液50μL至試劑盒配套的PCR管（含有PCR反應(yīng)需要的所有試劑），上機反應(yīng)，從上機運行開始到結(jié)束需3.5小時。

1.3沙門氏菌的確證和鑒定

1.3.1菌落形態(tài)觀察

在BS瓊脂平板上，菌落呈褐色至黑色，帶金屬光澤，菌落周圍培養(yǎng)基有褐色的暈環(huán)；在XLD瓊脂平板上，粉色菌落帶黑色中心，有些菌落呈現(xiàn)全黑色；HE瓊脂平板上，為帶黑色中心的藍色菌落；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，菌落呈品紅色，扁平透明，邊緣光滑，直徑約2mm。挑取上述的可疑菌落進行革蘭氏染色檢驗，觀察菌落形態(tài)。

1.3.2沙門氏菌鑒定

（1）生化鑒定。先從選擇性平板上分別挑取可疑菌落接種三糖鐵（TSI）瓊脂斜面，先底層穿刺，再斜面劃線。培養(yǎng)TSI瓊脂斜面時需保持需氧的環(huán)境，才能防止產(chǎn)生過量的硫化氫（H2S）使瓊脂變?nèi)?，因此TSI瓊脂斜面的試管最好使用棉花塞。另挑取數(shù)個可疑菌落于0.85%滅菌生理鹽水中，制成約0.5麥氏的菌懸液，將菌懸液分別接種于生化鑒定試劑管中，包括靛基質(zhì)（蛋白胨水）、pH7.2尿素、賴氨酸脫羧酶、氰化鉀（KCN）、甘露醇、山梨醇、β-半乳糖苷醇（ONPG），于36℃培養(yǎng)18～24h，必要時可延長培養(yǎng)時間至48h，觀察結(jié)果。

（2）血清學鑒定。一般采用1.2～1.5%瓊脂培養(yǎng)物做血清學鑒定，先挑取可疑菌落于營養(yǎng)瓊脂中進行純培養(yǎng)。沙門氏菌多價菌體抗原（O）血清鑒定，在玻片兩頭分別劃出1cm×2cm區(qū)域，挑一環(huán)待測菌落，兩邊各放1/2環(huán)，一邊滴一滴多價菌體抗原（O）血清，另一邊滴加無菌生理鹽水做對照。用無菌接種環(huán)將兩邊菌落研成乳狀液，在黑暗背景下觀察，任何程度凝集都是陽性反應(yīng)。多價鞭毛抗原（H）血清鑒定操作跟多價菌體抗原（O）血清一樣。

2 結(jié)果分析

生化鑒定的結(jié)果如下：靛基質(zhì)（-）、尿素（-）、KCN（-）、賴氨酸脫羧酶（+）、山梨醇（+）、甘露醇（+）、ONPG（-）；注：“-”表示陰性，“+”表示陽性。本次血清學試驗的疑是菌的多價菌體（O）抗原和多價鞭毛（H）抗原都出現(xiàn)了不同程度的凝集，同時生理鹽水對照中沒有出現(xiàn)凝集。結(jié)合生化鑒定和血清學鑒定的結(jié)果，可判定本次待測樣品沙門氏菌陽性。

3 結(jié)語

國標法鑒定結(jié)果準確可靠是公認的，但因沙門氏菌血清型種類多，生化特異性大，使得檢驗程序更加復雜，檢驗過程需要反復的接種培養(yǎng)，一般都需要4～7天才能出結(jié)果。美國杜邦公司的BAX致病菌檢測系統(tǒng)是利用PCR技術(shù)篩選樣品中致病菌的檢測系統(tǒng)之一，優(yōu)點在于特異性強，假陽性低，耗時短，從增菌到檢測48h內(nèi)可出檢驗結(jié)果。本次實驗用杜邦BAX@Q7的目的是先于傳統(tǒng)方法檢測出樣品中是否有沙門氏菌，為后面?zhèn)鹘y(tǒng)方法的平板分離和生化鑒定做準備。在已知陽性可能性很高的情況下，適量增加分離平板數(shù)和提高劃線質(zhì)量，著重對可疑菌進行檢測，有效提高檢測效率。

參考文獻

[1]GB 4789.4-2010.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗.

[2]劉喆，張書蕭，王少輝，陳曉平，等.沙門氏菌的檢測技術(shù)進展.

[3]曾麗華.淺談沙門氏菌的比對檢驗.