【摘要】 目的：探討不同濃度阿侖膦酸鈉對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外骨向誘導(dǎo)增殖和成骨誘導(dǎo)分化能力的影響。方法：取生長狀態(tài)良好的第四代細(xì)胞，分為實驗組（不同濃度的阿侖膦酸鈉，A-F組）、空白對照組（L-DMEM，G組）和陽性對照組（地塞米松，H組）各自誘導(dǎo)成骨分化。觀察細(xì)胞形態(tài)，放射免疫法檢測各組hBMSCs骨鈣素的分泌能力，實時熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中Runx2和Osx mRNA的表達情況，并檢測經(jīng)成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后細(xì)胞內(nèi)脂蛋白脂酶（LPL）mRNA的表達情況。結(jié)果：hBMSCs誘導(dǎo)分化至第7天時，A-F組大部分細(xì)胞仍呈長梭形，G組部分細(xì)胞開始出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變；各組細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣素均隨誘導(dǎo)分化時間推移而增多；各組細(xì)胞表達Osx和Runx2 mRNA也隨誘導(dǎo)分化時間推移而增多；hBMSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化21 d時，A-F組細(xì)胞Osx和Runx2 mRNA表達量進一步增加，E組和F組超過半數(shù)細(xì)胞陽性表達，高于其他阿倫磷酸鈉工作液誘導(dǎo)組；在陰性對照組，始終未見有細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、骨鈣素表達和Osx和Runx2 mRNA表達。結(jié)論：ALN能促進hBMSCs增殖和骨向分化，1×10-6mol/L為其誘導(dǎo)分化的合適濃度。

【關(guān)鍵詞】 阿侖膦酸鈉； 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 體外誘導(dǎo)； 骨向分化

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.14.075

阿侖膦酸鈉可以抑制各種情況下的骨量丟失，包括原發(fā)性骨質(zhì)疏松和肢體制動、雙側(cè)卵巢切除術(shù)后等各種原因造成的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松[1-2]，同時可以提高骨生物力學(xué)水平。研究發(fā)現(xiàn)在組織水平， 阿侖膦酸鈉能夠降低骨轉(zhuǎn)換，形成鈣正平衡，使骨量增加，但其分子機制目前還不十分清楚，一般認(rèn)為其作用的靶細(xì)胞為成熟的破骨細(xì)胞[3]，也有人認(rèn)為阿侖膦酸鈉在一定濃度下可影響成骨細(xì)胞的增殖，甚至可能促進成骨細(xì)胞成熟分化[4-5]，另外不排除在誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化方面起作用。目前，阿倫磷酸鈉對成骨細(xì)胞的增殖有不同的研究結(jié)果，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為適宜濃度下阿倫磷酸鈉促進成骨細(xì)胞的增殖，甚至可能促進成骨細(xì)胞增殖或成熟分。但其濃度相關(guān)性影響細(xì)胞增殖的機制有待進一步研究。筆者就不同濃度的阿侖膦酸鈉對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外骨向誘導(dǎo)進行實驗，發(fā)現(xiàn)了體外培養(yǎng)所需的最適濃度，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 所需試劑：L-DMEM（DMEM-低糖培養(yǎng)基， Gibco公司，美國）、胎牛血清（fetal bovin serum，F(xiàn)BS，杭州四季青）、0.25%胰酶/EDTA（杭州）、人淋巴細(xì)胞分離液（密度1.077 g/ml，天津市TBD生物中心）、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，武漢博士德）、青霉素/鏈霉素雙抗（杭州）、CD31、CD45、CD29、CD44小鼠抗人流式抗體（abcam）、FITC標(biāo)記大鼠抗小鼠二抗（武漢博士德）、IBMX（3-異丁基-1-甲基黃嘌呤）、胰島素和吲哚美辛均購自Sigma公司；油紅O購自Amresco公司；離心管、培養(yǎng)皿和96孔培養(yǎng)板（Corning， 美國）、倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）、C02培養(yǎng)箱（美國Thermo Formo公司）、離心機（Beckman Coulter）、Beckman Coulter流式細(xì)胞儀器、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、恒溫水箱和氣浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限）。

本實驗所有標(biāo)本均取自因骨性關(guān)節(jié)炎需行全髖關(guān)節(jié)置換或膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)的患者。同時本研究需排除患有其他骨關(guān)節(jié)疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、骨腫瘤、甲狀腺和甲狀旁腺疾病以及腎功能不全的患者。

1.2 誘導(dǎo)分化步驟 取融合至80%～90%第4代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進行分孔成骨誘導(dǎo)分化。每個96孔板分為8個組（A-H組，每組12孔），每個孔加入不同濃度的阿倫磷酸鈉工作液（購于石家莊制藥集團有限公司），濃度分別為1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L（分別為A-F組），同時設(shè)立空白對照組和陽性對照組，分別加入等體積不含阿倫磷酸鈉工作液的L-DMEM作為陰性對照組（G組），和加入含濃度為1×10-8 mol/L的地塞米松誘導(dǎo)液作為陽性對照組（H組）。將3個96孔板置于37 ℃、5%CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。3個96孔板細(xì)胞分別進行成骨誘導(dǎo)時間為7、14和21 d，誘導(dǎo)分化期間每2天換液1次。

1.3 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)向成骨分化的鑒定 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)向成骨分化第7、14和21天時，分別進行放射免疫法對細(xì)胞培養(yǎng)液中骨鈣素分泌能力進行檢測和采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測誘導(dǎo)分化后的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Runx2和Osx mRNA的表達情況，同時采用qRT-PCR檢測經(jīng)成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后細(xì)胞內(nèi)脂蛋白脂酶（LPL）mRNA的表達情況。

1.4 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)向成骨分化細(xì)胞形態(tài)變化 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行誘導(dǎo)成骨分化后，每2天顯微鏡下觀察一次細(xì)胞形態(tài)改變情況，同時觀察細(xì)胞生長、成骨分化情況。

1.5 放射免疫法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣素含量 骨鈣素放射免疫試劑盒購于中國原子能科學(xué)研究院。放射免疫儀型號為：Fj-2008全自動免疫計數(shù)儀（西安262廠生產(chǎn)）。放射免疫法的具體步驟參照試劑盒說明書。將成骨誘導(dǎo)分化7、14和21 d后的細(xì)胞培養(yǎng)基進行收集，分析培養(yǎng)基中骨鈣素的含量。

1.6 qRT-PCR檢測誘導(dǎo)分化細(xì)胞的LPL、Runx2、Osx、β-actin表達 通過以下五步驟進行操作：（1）引物設(shè)計合成；（2）細(xì)胞總RNA的提??；（3）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；（4）熒光定量PCR反應(yīng)；（5） LPL、Osx和Runx2 mRNA表達量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化形態(tài)改變 到第7天時，A-F組阿倫膦酸鈉工作液誘導(dǎo)組大部分細(xì)胞仍呈長梭形，只有小部分細(xì)胞見形態(tài)發(fā)生變化，空白對照細(xì)胞形態(tài)無明顯變化（圖1）。誘導(dǎo)分化至第14天時，阿倫膦酸鈉工作液組更多細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)改變，與誘導(dǎo)分化至第7天時比較，較多細(xì)胞由長梭形開始向圓形轉(zhuǎn)變，但細(xì)胞數(shù)量仍較少，各組細(xì)胞形態(tài)都在不同程度改變，在E組和F組，細(xì)胞形態(tài)改變較明顯?？瞻讓φ占?xì)胞仍無明顯變化。在地塞米松誘導(dǎo)分化組，細(xì)胞大多呈圓形并可見反光（圖2）。細(xì)胞誘導(dǎo)分化至第21天時，A-F組細(xì)胞誘導(dǎo)分化改變有所提高，尤其在E組和F組，與A-D組相比，較多細(xì)胞向成骨分化，在顯微鏡下觀察可見較多細(xì)胞有反光。在地塞米松誘導(dǎo)分化組細(xì)胞呈圓形，顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞可見反光（圖3）。

圖1 第7天各組細(xì)胞形態(tài)

注：A-F組大部分細(xì)胞仍呈長梭形，G組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化

圖2 第14天各組細(xì)胞形態(tài)

注：A-F組更多細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)改變

圖3 第21天各組細(xì)胞形態(tài)

注：A-F組細(xì)胞誘導(dǎo)分化改變有所提高

2.2 放射免疫法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣素含量 細(xì)胞誘導(dǎo)分化至第7、14和21天時，A-F組培養(yǎng)基中骨鈣素含量見表1，而骨鈣素含量有隨細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化而增加趨勢。

表1 各組培養(yǎng)基中骨鈣素含量 ng/ml

組別誘導(dǎo)分化時間

第7天第14天第21天

A組

B組

C組

D組

E組

F組

H組0.03±0.01*△#

0.03±0.02*△#

0.05±0.02*△#

0.05±0.02*△#

0.06±0.01*

0.08±0.02*

0.14±0.060.17±0.04*△#

0.19±0.05*△#

0.20±0.04*△#

0.21±0.05*△#

0.27±0.09*

0.28±0.08*

0.46±0.130.24±0.06*△#

0.25±0.05*△#

0.26±0.05*△#

0.27±0.06*△#

0.46±0.07*

0.52±0.06*

0.82±0.09

注：G組為空白對照組未能檢出骨鈣素，故表中未列G組；*與同一時間點H組比較，P<0.05；△與同一時間點E組比較，P<0.05；#與同一時間點F組比較，P<0.05

2.3 qRT-PCR檢測誘導(dǎo)分化細(xì)胞LPL、Runx2、Osx的表達見表2。

3 討論

目前關(guān)于阿侖膦酸鈉在誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的確切作用機制仍不清楚。文獻報道阿侖膦酸鈉對破骨細(xì)胞的作用可能通過以下作用機制：（1）阿侖膦酸鈉可有力吸附在骨的表面，阻止膦酸鹽晶體的生長和溶解，同時改變了骨基質(zhì)蛋白的特性，防止破骨細(xì)胞進行黏附。（2）阿侖膦酸鈉與骨結(jié)合后，一旦被破骨細(xì)胞酸化誘導(dǎo)，便在吸收位點局部釋放出來，干擾破骨細(xì)胞膜的完整性，使破骨細(xì)胞對一些小離子的通透性增加。同時在骨表面維持足夠的濃度梯度抑制破骨細(xì)胞活化的過程并抑制其泌酸過程。（3）阿侖膦酸鈉也可能作用于成骨細(xì)胞或BMSCs，間接抑制成熟破骨細(xì)胞的功能或抑制破骨細(xì)胞前提的增殖或分化，甚至有些學(xué)者認(rèn)為阿侖膦酸鈉并非直接作用于破骨細(xì)胞[6]，而是通過成骨細(xì)胞介導(dǎo)抑制破骨細(xì)胞活性，從而抑制骨吸收。Fabian等[7]經(jīng)過體外實驗證明阿侖膦酸鈉有促進BMSCs增殖和向成骨細(xì)胞分化的作用。蔣四清等[8]證明1×10-8 mol/L的阿侖膦酸鈉對成骨細(xì)胞有較強的增殖作用。成骨細(xì)胞的來源之一就是由BMSCs分化而來，而目前關(guān)于阿侖膦酸鈉對BMSCs成骨誘導(dǎo)分化的研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，阿侖膦酸鈉誘導(dǎo)分化BMSCs到第7天時，較少細(xì)胞向成骨分化，主要表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)改變不明顯，培養(yǎng)基中骨鈣素表達量低，同時qRT-PCR檢測成骨相關(guān)標(biāo)志物Osx和Runx2 mRNA在不同濃度組間表達量均較低且組間無明顯差別，而在地塞米松誘導(dǎo)分化組，一部分BMSCs已開始向成骨分化。誘導(dǎo)分化至第14天時，阿侖膦酸鈉誘導(dǎo)組的細(xì)胞成骨分化較第7天時有所提高，尤其在E和F兩個劑量較高組，細(xì)胞形態(tài)向成骨轉(zhuǎn)化增加，同時培養(yǎng)基中骨鈣素以及細(xì)胞中Osx和Runx2的mRNA表達量也相應(yīng)升高，與A-D較低濃度組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明較高濃度阿侖膦酸鈉組在誘導(dǎo)BMSCs向成骨分化至第14天時，已開始進入迅速誘導(dǎo)分化期。誘導(dǎo)分化至第21天時，在E和F組大多數(shù)細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、骨鈣素表達量和qRT-PCR證實向成骨轉(zhuǎn)化，在A-D組誘導(dǎo)分化也有所提高，提高相對較小。而在陰性對照組始終未見細(xì)胞改變。本研究證明1×10-6和1×10-5 mol/L濃度的阿侖膦酸鈉誘導(dǎo)液誘導(dǎo)BMSCs成骨分化至14 d時，已開始進入迅速分化期，誘導(dǎo)至21 d時成骨分化明顯比其他低濃度組好，而在E和F兩組間誘導(dǎo)分化差別不大，故筆者認(rèn)為1×10-6 mol/L濃度的阿侖膦酸鈉誘導(dǎo)液具有較好的誘導(dǎo)效率，雖然本研究只誘導(dǎo)分化了21 d，但已有半數(shù)以上的細(xì)胞向成骨分化，故推測隨著時間的延長將可能有更多細(xì)胞向成骨分化。

本研究初步證明，低濃度的阿侖膦酸鈉具有較好的誘導(dǎo)效應(yīng)，在臨床工作中，長期使用低濃度阿侖膦酸鈉將可以使從骨髓動員的BMSCs成骨分化率增加。筆者認(rèn)為1×10-6 mol/L濃度的阿侖膦酸鈉誘導(dǎo)BMSCs成骨分化至21 d已可以取得較好的效果，從而可為下一步研究阿侖膦酸鈉誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的分子生物學(xué)機制提供基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2012-12-12） （本文編輯：陳丹云）