王文俠，王龍艷，宋春麗，王允

(齊齊哈爾大學(xué)食品學(xué)院齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾，161006)

多糖是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸外的又一類重要的生物大分子物質(zhì)，具有增強(qiáng)免疫、抗衰老、抗氧化、抗癌、等作用［1］。硫酸化多糖是一類糖羥基上帶有硫酸根的多糖，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血和增強(qiáng)免疫等生物學(xué)活性［2］。自20世紀(jì)80年代以來，多糖的化學(xué)修飾己成為多糖構(gòu)效關(guān)系研究的重要手段，也是發(fā)現(xiàn)和研制多糖類藥物的重要途徑。日本學(xué)者研究了海藻中的硫酸多糖，發(fā)現(xiàn)其具有體內(nèi)抗氧化及抗腫瘤作用［3］;美國癌癥研究所對(duì)海洋無脊椎動(dòng)物篩選發(fā)現(xiàn)，其水相及堿相提取物顯示出較強(qiáng)的抗艾滋病病毒活性，而這些活性組分基本是硫酸多糖［4］。有些多糖本身無抗氧化活性或抗氧化活性較弱，但經(jīng)硫酸化修飾后表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。張麗萍等從金頂側(cè)耳子實(shí)體中分離純化得到一種多糖，經(jīng)硫酸酯化后，抗柯薩奇病毒 B5的活性明顯增強(qiáng)［5］。香菇多糖、牛膝多糖、高山紅景天多糖、黃精多糖的硫酸酯化的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展［6］。

豆渣是加工豆腐、豆乳、大豆蛋白等大豆制品的副產(chǎn)物。由于豆渣含水率高，不宜儲(chǔ)存，運(yùn)輸，易變質(zhì)，長期以來一直未能得到充分開發(fā)利用，除少部分豆渣作飼料外，大部分作為廢料棄掉。由于豆渣富含有非淀粉多糖，是制備高質(zhì)量植物多糖的重要原料。非淀粉多糖的提取可以采用堿提，過氧化氫堿提，酸提等多種提取方法［7］堿提應(yīng)用較為普遍，提取效果較好，鐘俊楨等［8］采用堿法提取豆渣中的半纖維素，提取率達(dá)到30.21%，但是堿法提取半纖維素通常存在所得產(chǎn)品色澤差的問題。王文俠［9］等采用堿性過氧化氫法提取豆渣半纖維素，豆渣半纖維素的提取率可高達(dá)38.47%，且色澤為乳白色。而有關(guān)豆渣多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾以及抗氧化活性等生理活性作用的研究還未見報(bào)道。

本文以堿性過氧化氫法提取的豆渣為原料，對(duì)氯磺酸-吡啶法制備硫酸酯化豆渣多糖的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，并研究了硫酸酯化豆渣多糖清除羥基自由基和DPPH·的能力，以期了解化學(xué)修飾對(duì)豆渣多糖抗氧化活性的影響，為豆渣多糖及其衍生物的抗氧化機(jī)理和天然抗氧化劑的開發(fā)利用提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆渣多糖，在實(shí)驗(yàn)室以豆渣為原料，采用堿性過氧化氫溶液提取，醇沉干燥制得。主要試劑包括氯磺酸、吡啶、二甲基甲酰胺、K2SO4、NaOH、無水乙醇、HCl、三氯乙酸、BaCl2、明膠、鄰二氮菲、K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、雙氧水等，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV757CRT紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;TDL-5-A型低速臺(tái)式離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;102041真空冷凍干燥機(jī)，CHRIST;HH-S1電熱恒溫水浴鍋，上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠;DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器，金壇市醫(yī)療儀器廠;JB300-D型強(qiáng)力電動(dòng)攪拌機(jī)，上海標(biāo)本模型廠;SHZ-D循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠;BS 124S分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;PB-10酸度計(jì)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 硫酸化豆渣多糖的制備

(1)硫酸酯化試劑的制備［10］。將預(yù)先在冰箱里冷卻的無水吡啶置于帶有冷凝管和攪拌裝置的三頸瓶中，以冰鹽浴冷卻，在劇烈攪拌狀態(tài)下按照一定比例緩慢滴加氯磺酸，反應(yīng)溫度控制在4℃ 左右，反應(yīng)40 min后得到淡黃色的酯化試劑。

(2)酯化反應(yīng)。準(zhǔn)確稱取一定量的豆渣多糖并將其溶解于一定體積N，N-二甲基甲酰胺中，加入配制好的硫酸酯化試劑，在一定溫度下攪拌反應(yīng)一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后用4 mol/L NaOH中和至pH值為7。測定產(chǎn)物硫酸酯化豆渣多糖的取代度。

1.3.2 酯化試劑比例對(duì)豆渣多糖取代度的影響

按照1.3.1的方法，調(diào)節(jié)V(氯磺酸)∶V(吡啶)的比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，將酯化試劑與多糖溶液的體積比，溫度和時(shí)間分別固定在4∶3、70℃和2 h，測定不同酯化試劑比例下硫酸酯化豆渣多糖的取代度。

1.3.3 酯化試劑與多糖溶液的體積比對(duì)豆渣多糖取代度的影響

按照1.3.1的方法，調(diào)節(jié)V(酯化試劑)∶V(多糖溶液)的比例為 4∶1、4∶2、4∶3、4∶4、4∶5，將酯化試劑比例，溫度和時(shí)間分別固定在1∶3、70℃和2 h，測定不同酯化試劑與多糖溶液體積比例下硫酸酯化豆渣多糖的取代度。

1.3.4 不同反應(yīng)溫度對(duì)豆渣多糖取代度的影響

按照1.3.1的方法，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度分別為30、50、70、90℃，將 V(氯磺酸)∶V(吡啶)的比例，酯化試劑與多糖溶液的體積比和時(shí)間分別固定在 1∶3、4∶3、2 h，測定不同反應(yīng)溫度下硫酸酯化豆渣多糖的取代度。

1.3.5 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)豆渣多糖取代度的影響

按照1.3.1的方法，調(diào)節(jié)反應(yīng)時(shí)間分別為1、2、3、4 h，將V(氯磺酸):V(吡啶)的比例，酯化試劑與多糖溶液的體積比和溫度分別固定在1∶3、4∶3、70℃，測定不同反應(yīng)時(shí)間下硫酸酯化豆渣多糖的取代度。

1.4 豆渣多糖硫酸酯化的最佳工藝條件確立

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法確定豆渣多糖硫酸酯化的工藝條件。

1.5 硫酸基含量的測定及取代度計(jì)算

硫酸基含量的測定采用氯化鋇-明膠濁度法［11］。

樣品處理:向完成酯化反應(yīng)后的溶液中加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，使乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%，離心分離后將沉淀溶于蒸餾水，流水透析72 h，蒸餾水透析12 h，真空濃縮，冷凍干燥得到硫酸酯化豆渣多糖。采用硫酸鋇濁度法測定硫酸酯化多糖硫酸基含量。

取代度計(jì)算公式為:

式中:S，硫酸酯化多糖中硫酸基的百分含量。

1.6 硫酸化豆渣多糖抗氧化活性的測定

1.6.1 對(duì)羥基自由基的清除能力

鄰二氮菲-Fe2+氧化法［12］主要用于抗氧化研究中檢測離體試驗(yàn)體系中羥自由基的氧化作用，是一種比色測定方法，特別是對(duì)于抗氧化劑的選擇有重要的價(jià)值。

H2O2/Fe2+體系通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，鄰二氮菲-Fe2+水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+后，造成其水溶液在波長536 nm處最大吸收峰消失。以此測算其清除率。

方法:按表1加未硫酸酯化的原豆渣多糖及在最優(yōu)酯化條件下制備的硫酸化豆渣多糖樣，測定它們對(duì)OH·的抑制作用。加入多糖液后搖勻放入37℃水浴中保溫1h后，測定其在536 nm處的吸光度值，清除率按下式計(jì)算。

其中:A0，未損傷管的吸光值;A1，損傷管的吸光值;A2，樣品管的吸光值。

表1 鄰二氮菲-H2O2/Fe2+體系加樣表Table 1 Sample list of phenanthroline-H2O2/Fe2+system

1.6.2 對(duì)DPPH·的清除能力

DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能清除它，則表明受試物具有降低羥基自由基、烷自由基或過氧自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。DPPH·有個(gè)單電子，在517 nm有強(qiáng)吸收，其甲醇溶液呈深紫色，加入受試物后，在517 nm可以檢測其對(duì)DPPH·清除效果。因此，根據(jù)消退速度和峰值改變程度可以用517 nm來檢測自由基的清除情況，從而評(píng)價(jià)試驗(yàn)樣品的抗氧化能力［13］。

將未硫酸酯化的原豆渣多糖及在最優(yōu)酯化條件下制備的硫酸化豆渣多糖樣品溶解，配制成不同濃度的溶液。取1 mL供試液與3 mL 0.2 mrnol/L DPPH·溶液均勻混合。反應(yīng)30 min后在517 nm處測定其吸光度Ai，同法測定3 mL 0.2 mrnol/L DPPH·溶液與1 mL蒸餾水混合后的吸光度Ac，以及供試液本身的吸光度Aj。依據(jù)下列公式計(jì)算清除率Y。

其中:Y，DPPH·自由基清除率;Ac，不加供試液的吸光度;Ai，加入供試液后的吸光度;Aj，供試液本身的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸酯化修飾豆渣多糖的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酯化試劑比例對(duì)豆渣多糖取代度的影響

酯化試劑比例對(duì)豆渣多糖取代度的影響如圖1所示。

圖1 酯化試劑比例對(duì)豆渣多糖取代度的影響Fig.1 The effect of esterification reagent ratio on degree of substitution of the bean dregs polysaccharide

如圖1所示，當(dāng)氯磺酸和吡啶的體積比大于1∶3時(shí)取代度隨之下降。氯磺酸是一種強(qiáng)酸物質(zhì)，當(dāng)體積比小于1∶2時(shí)，反應(yīng)體系中氯磺酸的含量太高，酸性太強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致多糖部分降解，且容易產(chǎn)生板結(jié)現(xiàn)象，很難攪拌，反應(yīng)會(huì)不均勻，影響了硫酸化的效果。而氯磺酸又是親電試劑，提供硫酸基團(tuán)，其用量會(huì)對(duì)產(chǎn)物的取代度有一定的影響，因此當(dāng)酯化試劑體積比大于1∶3時(shí)，氯磺酸含量隨之減少，酯化不完全，取代度降低。因此，氯磺酸與吡啶的體積比太大或太小，都會(huì)影響硫酸酯化的效果，因此選最佳比例為1∶3。

2.1.2 酯化試劑與多糖溶液的體積比對(duì)豆渣多糖取代度的影響

酯化試劑與多糖溶液的體積比對(duì)豆渣多糖取代度的影響如圖2所示。

圖2 酯化試劑與多糖溶液的體積比對(duì)豆渣多糖取代度的影響Fig.2 The effect of esterification reagent and polysaccharide solution volume ratio on the degree of substitution of bean dregs polysaccharide

如圖2所示，當(dāng)酯化試劑與多糖溶液的體積比低于4∶3時(shí)，出現(xiàn)碳化現(xiàn)象，影響了酯化效果;當(dāng)體積比大于4∶3時(shí)，多糖溶液過多，不能完全酯化。因此選擇酯化試劑與多糖溶液的最佳比例為4∶3。

2.1.3 不同反應(yīng)溫度對(duì)豆渣多糖取代度的影響

不同反應(yīng)溫度對(duì)豆渣多糖取代度的影響如圖3所示。

圖3 不同反應(yīng)溫度對(duì)豆渣多糖取代度的影響Fig.3 The effect of different reaction temperature on the degree of substitution of bean dregs polysaccharide

如圖3所示，隨著反應(yīng)溫度的增加，取代度呈先增加又降低的趨勢。當(dāng)溫度大于70℃時(shí)，取代度降低，可能是由于豆渣多糖在高溫的酸性環(huán)境下發(fā)生了降解。因此選擇最佳反應(yīng)溫度為70℃。

2.1.4 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)豆渣多糖取代度的影響

不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)豆渣多糖取代度的影響如圖4所示。

如圖4所示，隨著時(shí)間的增加，豆渣多糖的取代度呈先增加后降低的趨勢。一定范圍內(nèi)，酯化時(shí)間增加，有助于酯化反應(yīng)的進(jìn)行;但是在高酸性的條件下，酯化時(shí)間過長，也會(huì)引起多糖的部分降解，導(dǎo)致酯化度有所下降。因此選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為2 h。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)豆渣多糖取代度的影響Fig.4 The effect of different reaction time on the degree of substitution of bean dregs polysaccharids

2.2 硫酸酯化豆渣多糖正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

按照酯化試劑比例、酯化試劑與多糖溶液的體積比、溫度和時(shí)間做4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示，結(jié)果見表3。

表2 因素水平表Table 2 Ffactors and levels table

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal test

由表3極差分析結(jié)果可以看出，各因素的作用按大小排序如下:A＞B＞C＞D，即酯化試劑比例對(duì)酯化度影響最大，其次是酯化試劑與多糖溶液的體積比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間。由k值可知最佳組合為A2B2C3D1。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果如表4所示，因素A，B，C，D顯著。最佳組合A2B2C3D1試驗(yàn)經(jīng)再次驗(yàn)證取代度為最大，因此確定最佳的硫酸酯化工藝條件為:酯化試劑比例為1∶3，酯化試劑與多糖溶液體積比為4∶3，反應(yīng)溫度為80℃，反應(yīng)時(shí)間為2.5 h。

表4 方差分析Table 4 Variance analaysis

2.3 硫酸酯化豆渣多糖的抗氧化活性

2.3.1 對(duì)羥基自由基的清除能力

測定最優(yōu)硫酸酯化條件下制備的硫酸化豆渣多糖對(duì)羥基自由基的清除能力如圖5所示。

圖5 豆渣多糖和硫酸化豆渣多糖對(duì)羥基自由基的清除率Fig.5 The clearance ration of bean dregs polysaccharides and sulphation bean dregs polysaccharids on the hydroxyl free radical

由圖5可以看出，豆渣多糖和硫酸化豆渣多糖均有清除羥基自由基的能力。隨著濃度的增加，清除率也隨之增加，且硫酸化豆渣多糖對(duì)羥自由基的清除能力均大于豆渣多糖，這是因?yàn)槎乖嗵擎溨幸肓肆蛩峄?，使糖分子極性增大，溶解度增加，黏度降低，從而增強(qiáng)了與羥自由基的結(jié)合能力。

2.3.2 對(duì)DPPH·的清除能力

測定最優(yōu)硫酸酯化條件下制備的硫酸化豆渣多糖對(duì)DPPH·的清除能力如圖6所示。

由圖6可以看出，豆渣多糖和硫酸化豆渣多糖均有清除DPPH·的能力。隨著濃度的增加，清除率也隨之增加，且硫酸化豆渣多糖對(duì)DPPH·的清除能力均大于豆渣多糖，這是因?yàn)槎乖嗵擎溨幸肓肆蛩峄?，使糖分子極性增大，溶解度增加，黏度降低，從而增強(qiáng)了與DPPH·的結(jié)合能力。

3 結(jié)論

圖6 豆渣多糖和硫酸化豆渣多糖對(duì)DPPH·的清除率Fig.6 The clearance ratio of bean dregs polysaccharides and sulphation bean dregs polysaccharide on the DPPH·

(1)采用氯磺酸-吡啶法制備硫酸酯化豆渣多糖，通過正交試驗(yàn)得出的最佳酯化條件為:氯磺酸與吡啶的體積比為1∶3，酯化試劑與多糖溶液的體積比為4∶3，反應(yīng)溫度為80℃，反應(yīng)時(shí)間為2.5 h。在此條件下，豆渣多糖取代度達(dá)到2.15。

(2)豆渣多糖及硫酸化豆渣多糖對(duì)羥基自由基和DPPH·均有一定的清除作用，并呈明顯的量效關(guān)系。而且，經(jīng)過硫酸化修飾的豆渣多糖明顯比未經(jīng)修飾前的豆渣多糖的抗氧化活性顯著提高。

(3)氯磺酸-吡啶法優(yōu)化硫酸化豆渣多糖的工藝可行，使得豆渣多糖有了更廣闊的應(yīng)用前景。

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