彭登峰，柴春祥，馬玲，王偉

1(天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津，300314)

2(山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷，030801)

Mozzarella干酪中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類和有機酸，營養(yǎng)價值非常高。干酪中的蛋白質(zhì)經(jīng)過發(fā)酵成熟后，由于凝乳酶和發(fā)酵劑微生物產(chǎn)生的蛋白分解酶的作用，形成了多肽等可溶性物質(zhì)［1］。

酪蛋白抗菌肽是具有抗菌活性的一類短肽，廣泛存在于生物界，是先天免疫的重要防御物質(zhì)，具有廣譜抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲及抗腫瘤等生物活性［2］。干酪中豐富的酪蛋白是抗菌肽的重要來源，近年來干酪中酪蛋白抗菌肽的抑菌性引起了人們的廣泛關注和研究。據(jù)國內(nèi)外研究報道，已于酪蛋白酶解物中發(fā)現(xiàn)了多種具有抑菌性的抗菌肽［3］。第一個發(fā)現(xiàn)的抗菌肽是由Jones＆Simms(1930)提取的，他們發(fā)現(xiàn)了一種物質(zhì)能夠抑制鏈球菌的增長，把這種物質(zhì)命名為乳抑菌素。之后，另外一個研究小組也發(fā)現(xiàn)了一種從酪蛋白提取的抗菌肽，這種抗菌肽可能是來自k-酪蛋白和αs1-酪蛋白，并對金黃色葡萄球菌有抑制作用［4］。

目前我國對干酪抗菌肽的研究較少，而且對干酪的綜合利用不高。為此，本試驗以不同成熟期的Mozzarella干酪為原料，用3種方法制備干酪的提取液，以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉為指示菌，驗證提取液的抗菌性。本試驗的意義在于驗證干酪中提取液的生理功能以及對微生物的抑制作用，為干酪抗菌肽的進一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)和理論前提。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器設備

1.1.1 原料乳

新鮮牛乳，來源于山西農(nóng)業(yè)大學牧站，密度1.030 g/mL，干物質(zhì)11.05%，蛋白含量3.03%，酪蛋白含量2.27%，將脂肪標準化至3.0%，使C/F(酪蛋白∶脂肪)的比值為0.76。

1.1.2 供試菌種

Streptococcus salivarius subsp.Thermophilus(唾液鏈球菌嗜熱亞種)CH9、Lactobacillus delbrueckil subsp.bulgaricus(保加利亞乳桿菌德氏亞種)LB，來源于山西農(nóng)業(yè)大學畜產(chǎn)品實驗室。

大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、酵母菌(S.cerevisiae)和黑曲霉(Aspergillus niger)，來源于山西農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室。

1.1.3 凝乳酶

Stamix1150，CHR HANSEN 生產(chǎn)，活力為35 000RU/g。

1.1.4 主要試劑

NaOH，冰醋酸，醋酸鈉，蒸餾水，三氯乙酸，來源于山西農(nóng)業(yè)大學畜產(chǎn)品實驗室。

1.1.5 主要儀器與設備

自制干酪槽(加工量為2 L)、干酪刀、干酪模具、培養(yǎng)皿、牛津杯、濾紙片(山西農(nóng)業(yè)大學畜產(chǎn)品實驗室提供);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠);電熱恒溫鼓風干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);HPP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);單式真空包裝機(溫州市鼎力包裝機械制造有限公司);DL-CJ-2F醫(yī)療型潔凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);LC406立式冷藏陳列柜(江蘇阪神電器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Mozzarella干酪的制作［5］

參照文獻［5］來制作Mozzarella干酪。

1.2.2 Mozzarella干酪抗菌物質(zhì)的提取

無菌蒸餾水提取法:稱取Mozzarella干酪30 g，經(jīng)切碎、研磨后放入燒杯中，然后向燒杯中加入100 mL無菌蒸餾水，攪拌均勻后靜置1 h，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)到貼壁狀態(tài)，然后用少量的無菌蒸餾水把貼壁物質(zhì)溶解出來，倒入清洗干凈并經(jīng)過殺菌的小瓶中。

醋酸-醋酸鈉緩沖溶液提取法:稱取Mozzarella干酪30 g，經(jīng)切碎、研磨后放入燒杯中，然后向燒杯中加入100 mL pH值為4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，其余同無菌蒸餾水提取法。

三氯乙酸溶液提取法:稱取Mozzarella干酪30 g，經(jīng)切碎、研磨后放入燒杯中，然后向燒杯中加入100 mL 12%的三氯乙酸溶液，其余同無菌蒸餾水提取法。

本試驗根據(jù)干酪的成熟時間(40、50、60 d)分3次提取，每次提取時用上面3種提取方法。

1.2.3 菌種活化［6］

將經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基裝入試管后擺斜面，在無菌條件下用劃線法將供試菌種移接入相應的斜面培養(yǎng)基上，于37℃ 培養(yǎng)18～24 h，進行菌種斜面活化。

1.2.4 接種涂布

取無菌培養(yǎng)皿，做標記后迅速倒入滅菌后冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基20 mL，并快速而輕巧地晃動培養(yǎng)皿，平置冷卻備用［7］。

分別在培養(yǎng)皿中用移液槍移取少量的無菌蒸餾水，滴到培養(yǎng)皿的中央，然后根據(jù)培養(yǎng)皿的標記分別接種大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉，接種時要將菌融在無菌蒸餾水中，然后用涂布器涂勻。

1.2.5 提取液抗菌活性的測定

參照文獻(Bulet et al.1991)并做適當改進，采用濾紙片法(唐裕芳等，2005)和牛津杯法測定提取液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉的抑制作用［7-8］。

濾紙片法:用無菌鑷子夾住滅菌后的濾紙片分別在不同的提取液中浸泡一下，在瓶口濾去多余樣液，然后根據(jù)培養(yǎng)皿的標記貼到相應的位置，貼完后把培養(yǎng)皿放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，取出，觀察抑菌效果和測量抑菌圈的直徑。

牛津杯法:用無菌鑷子夾住滅菌后的牛津杯放入培養(yǎng)皿相應位置，然后用移液槍根據(jù)標記移取30 μL的提取液于牛津杯中，移取完后把培養(yǎng)皿放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，取出，觀察抑菌效果和測量抑菌圈的直徑。

1.2.6 空白的制作

分別量取100 mL的無菌蒸餾水、pH值為4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和12%的三氯乙酸溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)到貼壁狀態(tài)，然后用少量的無菌蒸餾水把貼壁的物質(zhì)溶解出來，倒入清洗干凈并經(jīng)過殺菌的小瓶中。

根據(jù)培養(yǎng)皿的標記用濾紙片法和牛津杯法測定3種空白提取液是否對試驗結(jié)果造成影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mozzarella干酪提取液對大腸桿菌的抑制作用

由圖1、圖2可以看出，不同成熟期Mozzarella的干酪，用3種不同提取方法進行提取，其提取液對大腸桿菌都有一定的抑制作用。

無菌蒸餾水提取的成熟期為40 d Mozzarella干酪的提取液對大腸桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為1.75 cm;醋酸-醋酸鈉緩沖溶液提取的成熟期為60 d Mozzarella干酪的提取液對大腸桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為1.95 cm;TCA提取成熟期為50 d Mozzarella干酪的提取液對大腸桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為2.50 cm。

圖1 干酪的提取液對大腸桿菌的抑制作用Fig.1 The antibacterial effect of cheese extract on Escherichia coli

圖2 不同成熟期Mozzarella干酪的提取液對大腸桿菌的抗菌性Fig.2 The antibacterial activity of Mozzarella cheese extract during different ripening on Escherichia coli

2.2 Mozzarella干酪的提取液對枯草芽孢桿菌的抑制作用

由圖3可以看出3種不同提取方法提取的不同成熟期Mozzarella干酪的提取液對枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用。

圖3 干酪的提取液對枯草芽孢桿菌的抑制作用Fig.3 The antibacterial effect of Cheese extract on Bacillus subtilis

無菌蒸餾水提取的成熟期為40 d Mozzarella干酪的提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為1.71 cm;用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液提取的成熟期為40 d Mozzarella干酪的提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為2.68 cm;用TCA提取的成熟期為60 d Mozzarella干酪的提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為3.51 cm。

2.3 Mozzarella干酪的提取液對酵母菌的抑制作用

由圖4可以看出3種不同提取方法提取的不同成熟期Mozzarella干酪的提取液對酵母菌都有一定的抑制作用。

圖4 干酪的提取液對酵母菌的抑制作用Fig.4 The antibacterial effect of cheese exfract on S.cerevisiae

用無菌蒸餾水提取的成熟期為50 d Mozzarella干酪的提取液對酵母菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為1.11 cm，在40、60 d時用無菌蒸餾水制備的提取液對酵母菌沒有抑制作用;用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液提取法提取出Mozzarella干酪成熟40、50 d時的提取液對酵母菌的抑菌性差不多，抑菌圈直徑分別為1.30 cm和1.28 cm，Mozzarella干酪成熟60 d時用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液制備的提取液對酵母菌的抑菌性相對較差，抑菌圈直徑為1.20 cm，用TCA提取法提取出Mozzarella干酪成熟60 d時的提取液對酵母菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為2.93 cm。

2.4 Mozzarella干酪的提取液對黑曲霉的抑制作用

圖5 干酪的提取液對霉菌的抑制作用Fig.5 The antibacterial effect of cheese extract on Aspergillus niger

由圖5可以看出用無菌蒸餾水提取的Mozzarella干酪成熟40、50、60 d時的提取液對黑曲霉沒有抑制作用;用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液提取的Mozzarella干酪成熟50 d時的提取液對黑曲霉的抑菌性最強，抑菌圈直徑為1.06 cm;用TCA提取法提取的Mozzarella干酪成熟60 d時的提取液對黑曲霉的抑菌性最強，抑菌圈直徑為2.10 cm。

3 結(jié)論

(1)用無菌蒸餾水提取的Mozzarella干酪在不同成熟期的提取液對黑曲霉沒有抑制作用，而對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌抑菌效果較為明顯;醋酸-醋酸鈉緩沖溶液提取法和TCA提取法提取Mozzarella干酪在不同成熟期的提取液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉有較強的抑制作用。

(2)用無菌蒸餾水提取法提取出Mozzarella干酪成熟40 d時的提取液對大腸桿菌的抑菌性最強，用TCA提取法提取出Mozzarella干酪成熟60 d時的提取液對枯草芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉的抑菌性最強。用TCA提取法提取Mozzarella干酪在不同成熟期的提取液對4種菌的抑制作用相對較好。

［1］ 駱承庠.乳與乳制品工藝學(第二版)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1999.

［2］ 鄭俏然，李誠.胃蛋白酶水解牛乳酪蛋白產(chǎn)物抑菌特性的研究［J］. 食品科技，2009，34(6):179-181.

［3］ 杜軍，袁永俊，侯恩娟，等.酪蛋白酶解物中抗菌肽的抑菌性及穩(wěn)定性研究［J］.中國乳品工業(yè)，2012，40(1):22-24.

［4］ Iván López Expósito，Isidra Recio.Antibacterial activity of peptides and folding variants from milk proteins［J］.International Dairy Journal，2006，11(16):1 294-1 305.

［5］ 劉會平，南慶賢，馬長偉，等.不同工藝參數(shù)對Mozzarella干酪質(zhì)構(gòu)和功能特性的影響［J］.中國食品學報，2006，6(2):20-28.

［6］ 宗緒巖，李麗，羅惠波，等.啤酒糟蛋白水解物對金黃色葡萄球菌抑菌能力研究［J］.食品與機械，2012，28(1):108-111.

［7］ 趙玲，曹榮，劉淇，等.南極磷蝦酶解提取液的抑菌活性［J］. 漁業(yè)科學進展，2011，32(4):112-116.

［8］ 黃小炯，區(qū)子弁.銀杏抗菌蛋白的提取及其抗菌性研究［J］. 食品工藝科技，2008(10):139-145.