劉書磊，黃永忠，黃虹，楊成，王水興

1(南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌，330047)

2(江西省豐城市荷湖農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站，江西豐城，331100)3(江西省農(nóng)科院，江西南昌，330200)

環(huán)糊精是一類由6個及以上D-吡喃葡萄糖單元組成的環(huán)狀葡聚糖，作為一類特殊的智能分子，其擁有筒狀的疏水內(nèi)腔和親水外表，可以與適當(dāng)形狀和大小的客體分子形成包合物，從而改變客體分子的水溶性、穩(wěn)定性和揮發(fā)性等。目前已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、輕工以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域［1-3］。

麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶(amylomaltase)正是一類可將直鏈淀粉轉(zhuǎn)化成環(huán)糊精的淀粉酶，其作用于直鏈淀粉可以得到聚合度(指D-吡喃葡萄糖單元數(shù))10～50不等的大環(huán)糊精(聚合度大于9的環(huán)狀糊精及為大環(huán)糊精)。麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶不僅可以催化分子內(nèi)(環(huán)化作用)和分子間(歧化作用)的轉(zhuǎn)糖基作用，還可以將環(huán)糊精的環(huán)打開將其偶聯(lián)到受體糖上(偶聯(lián)作用)，同時還具有水解作用［4-7］?；诖?，不同的環(huán)境條件對該酶的不同活性可能表現(xiàn)出不同的影響，從而影響最終環(huán)糊精的得率。為此，研究不同環(huán)境條件對麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶合成環(huán)糊精的影響，對提高環(huán)糊精得率具有一定的意義。

本研究以直鏈淀粉作為底物，通過麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶催化合成環(huán)糊精，主要研究了反應(yīng)過程中底物濃度、酶濃度、溫度、pH以及小分子有機(jī)物對環(huán)糊精得率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器設(shè)備

直鏈淀粉:購自sigma公司。

麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶:本實驗室構(gòu)建的基因工程菌所表達(dá)［8］。

二甲基亞砜、無水乙醇(均為分析純):天津市永大化學(xué)試劑有限公司;麥芽糖:北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;3，5-二硝基水楊酸(化學(xué)純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖測定試劑盒:上海榮盛生物技術(shù)有限公司;β-淀粉酶:Novozymes贈送;Tris-HCl緩沖液自制。

752C紫外可見分光光度計:上海第三分析儀器廠;恒溫水浴鍋:德國LAUDA公司T型;pHS-3C型精密pH計:上海雷磁儀器廠;臺式冷凍離心機(jī):sigma公司;電子分析天平:日本AND公司ER-180A型。

1.2 方法

1.2.1 還原糖的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線采用 GAIL LORENZ MILLER 的方法［9］。

含量測定:根據(jù)初始糖的含量吸取相應(yīng)體積的樣品(最多不超過120 μL，不足者用蒸餾水補(bǔ)充至120 μL)于試管中，再分別加入100 μL蒸餾水和150 μL DNS試劑，搖勻，沸水浴10 min，冷水浴冷卻至室溫后分別用蒸餾水定容至3.5 mL，在波長540 nm處測溶液吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算還原糖的量。環(huán)化產(chǎn)率計算:

1.2.2 酶活力測定

準(zhǔn)確吸取500 μL 10%(w/v)麥芽糖溶液(稱取一定量麥芽糖，溶于Tris-HCl緩沖液)于具塞試管中，加入100 μL酶液，搖勻，35℃反應(yīng)10 min后立即沸水浴滅活。以預(yù)先滅活的酶液為對照組，用葡萄糖氧化酶法測定測定葡萄糖的量［10］。

酶活力單位定義為:在上述條件下每分鐘增加1μmol葡萄糖所需要的酶量為1個活力單位。結(jié)果測得本研究中使用的麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶的酶比活力為1U/mL。

1.2.3 不同因素對環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

1.2.3.1 本實驗環(huán)糊精的制備方法

取一定量直鏈淀粉溶液(準(zhǔn)確稱取50 mg直鏈淀粉加入5 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，溶解后加入5 mL 0.5 mol/L HCl，蒸餾水定容至10 mL，馬上使用)于具塞試管中，加入適量酶液，用Tris-HCl緩沖液定容到1 mL，35℃水浴反應(yīng)，分別于 30、60、90、120、150 min取樣150μL，立即沸水浴10 min，冷卻后分別加入1 μL β-淀粉酶，50℃反應(yīng) 5 h，沸水浴 10 min 后，6 000 g ×5 min 離心［11］。

原始組:先將酶液沸水浴10 min滅活后，再按相應(yīng)比例加入直鏈淀粉溶液和緩沖液，其他操作與實驗組都相同。

對照組:用蒸餾水代替直鏈淀粉溶液，其他操作與實驗組都相同。

1.2.3.2 各種因素對轉(zhuǎn)化率的影響

參照1.2.3.1節(jié)方法，其中加入一定量直鏈淀粉溶液與相應(yīng)的酶量，Tris-HCl緩沖液為50 mmol pH 7.2。取不同時間的反應(yīng)液經(jīng)β-淀粉酶消化后測上清液中還原糖的量，并依據(jù)還原糖的量計算環(huán)化產(chǎn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響

終濃度分別為 0.050%、0.075%、0.100%、0.125%、0.150%的淀粉溶液與0.1U的酶反應(yīng)，底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響見圖1。

圖1 底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on conversion rate

從圖1可以看出，隨著底物濃度的提高環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率并不是隨之下降的，而是先升高后降低，這是由于當(dāng)?shù)孜餄舛冗^低時，麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶除了表現(xiàn)環(huán)化活性外，更多的表現(xiàn)出了水解活性，生成了相對較多的小分子糖，而環(huán)化反應(yīng)對小分子糖的利用率更低。但底物的濃度過高其轉(zhuǎn)化率自然會降低。由此可以推斷，底物濃度只有在一定的范圍內(nèi)，才會有相對較高的轉(zhuǎn)化率。

2.2 酶量對轉(zhuǎn)化率的影響

終濃度為0.10%的淀粉溶液與0.05、0.10、0.15、0.20U的酶分別反應(yīng)，酶量對轉(zhuǎn)化率的影響見圖2。

圖2 酶量對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of the dosage of enzyme on conversion rate

從圖2可以看出，隨著酶用量的增加環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率在反應(yīng)的最初一段時間是逐漸增加的，但隨著反應(yīng)時間的延長高酶量并沒有使得轉(zhuǎn)化率隨之有明顯的升高，但酶量過低時其轉(zhuǎn)化率雖然在隨著反應(yīng)時間的延長不斷增加，但反應(yīng)150 min時其轉(zhuǎn)化率仍明顯低于其他組。由此可以推斷，當(dāng)酶用量增加到一定值時反應(yīng)體系中環(huán)糊精的生成速度與分解速度基本一致，底物的轉(zhuǎn)化率基本保持恒定。

2.3 pH值對轉(zhuǎn)化率的影響

終濃度為1.0‰的淀粉溶液與0.1U的酶反應(yīng)，用50 mmol的Tris-HCl緩沖液控制反應(yīng)體系pH分別為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0。pH 值對轉(zhuǎn)化率的影響見圖3。

圖3 pH值對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of pH on conversion rate

從圖3可以看出，pH 6.5時底物的轉(zhuǎn)化率最高，說明在該pH值時麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的環(huán)化活性最高，而pH為5.0和9.0時轉(zhuǎn)化率明顯降低，說明該酶在這兩個pH值時很不穩(wěn)定，隨著反應(yīng)的進(jìn)行快速失活，此外由于隨著聚合度的增大環(huán)糊精在過低的pH值條件下穩(wěn)定性會降低，這也可能是pH 5.0時轉(zhuǎn)化率低的一個原因。由此可以推斷該酶的環(huán)化最適pH為6.08.0，在環(huán)化反應(yīng)中選擇合適的pH值對轉(zhuǎn)化率影響很大。

2.4 溫度對轉(zhuǎn)化率的影響

終濃度為1.0‰的淀粉溶液與0.1U的酶反應(yīng)，反應(yīng)溫度分別為 20、30、35、40、45、50、60℃。溫度對轉(zhuǎn)化率的影響見圖4。

圖4 溫度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of temperature on conversion rate

從圖4可以看出，在40℃條件下底物的轉(zhuǎn)化率始終是最高的，說明在所選溫度中40℃是環(huán)化反應(yīng)的最適溫度;在20℃和30℃的條件下，150 min時轉(zhuǎn)化率基本40℃時持平，可見在這兩個溫度下麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶能在150 min內(nèi)保持相當(dāng)高的活性;在60℃條件下，60 min時轉(zhuǎn)化率增長極其緩慢，說明該酶在60 min之內(nèi)，其環(huán)化活性快速失活。由此可知，選擇合適的反應(yīng)溫度不僅可以使酶保持較高的活性，更可以使反應(yīng)快速到達(dá)較高的轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而縮短反應(yīng)時間。

2.5 有機(jī)小分子對轉(zhuǎn)化率的影響

終濃度為1.0‰的淀粉溶液與0.1U的酶反應(yīng)，分別加入麥芽糖是其終濃度為0.5mg/mL、1.0mg/mL;無水乙醇使其終濃度為5%、10%;二甲基亞砜使其終濃度為5%、10%。這3種有機(jī)小分子對轉(zhuǎn)化率的影響分別如下圖5、圖6和圖7所示。

從圖5可以看出，麥芽糖的加入使底物的轉(zhuǎn)化率明顯降低。這是由于麥芽糖的加入增加了轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的受體，就使得麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的歧化反應(yīng)和偶聯(lián)反應(yīng)更容易發(fā)生，這樣就抑制了環(huán)糊精的生成。當(dāng)加入麥芽糖終濃度為1.0 mg/mL的時候其底物轉(zhuǎn)化率反而比終濃度為0.5 mg/mL時有所提高，這可能是由于在麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的作用下，加入的麥芽糖多次參與反應(yīng)生成，其中有一部分經(jīng)環(huán)化反應(yīng)參與了環(huán)糊精的合成，但整體表現(xiàn)仍為抑制。由此可以推斷，反應(yīng)體系中麥芽糖的加入會抑制環(huán)糊精的生成。

圖5 麥芽糖對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of maltose on conversion rate

圖6 乙醇對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of ethanol on conversion rate

圖7 二甲基亞砜對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of dimethyl sulfoxide on conversion rate

從圖6可以看出，乙醇的加入使底物的轉(zhuǎn)化率在30 min時大幅提高至約35%，這是由于乙醇的分子極性較高，當(dāng)其加入后與反應(yīng)體系中的聚糖分子通過氫鍵相結(jié)合，進(jìn)而抑制分子間歧化反應(yīng)的發(fā)生，這樣大量的直鏈淀粉只能自身進(jìn)行環(huán)化生成環(huán)糊精。但隨著反應(yīng)的進(jìn)行麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶其他的活性使得轉(zhuǎn)化率又有所下降。另外可能由于高濃度乙醇的存在對底物在溶液中穩(wěn)定性有一定的影響，而使得添加乙醇至終濃度為10%時反比終濃度為5%時轉(zhuǎn)化率有所下降，但仍高于未加乙醇時的轉(zhuǎn)化率。由此可知，乙醇的加入可以提高環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率。

從圖7可以看出，二甲基亞砜的加入使底物的轉(zhuǎn)化率所表現(xiàn)出的情況與加入乙醇時非常相似，其原因同樣是由于二甲基亞砜的分子極性很高，一定成都上抑制了歧化反應(yīng)。但與乙醇不同的是當(dāng)其較高濃度時轉(zhuǎn)化率也隨之有所提高，這可能是作為“萬能溶劑”二甲基亞砜加強(qiáng)了底物溶液的穩(wěn)定性所致。由此可推斷，二甲基亞砜可提高環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率。

3 結(jié)論

本文研究了底物濃度、酶量、溫度、pH、麥芽糖、乙醇、二甲基亞砜對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響，表明底物濃度過高和過低都會使轉(zhuǎn)化率下降，而酶用量對最終轉(zhuǎn)化率影響不大，最適轉(zhuǎn)化pH值是6.5，最適轉(zhuǎn)化溫度是40℃，麥芽糖對環(huán)糊精的合成起抑制作用，乙醇和二甲基亞砜能通過抑制麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的歧化反應(yīng)提高轉(zhuǎn)化率。

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