張寧，曾艷華，吳希陽，彭喜春，黃雪松

(暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州，510632)

大蒜果聚糖是大蒜深加工后廢棄蒜渣中的主要成分，對其結(jié)構(gòu)的研究表明，大蒜果聚糖不同于菊糖，果糖分子之間通過β-2，1和β-2，6糖苷鍵連接，是帶有支鏈的果聚糖［1］。由于人體不能產(chǎn)生相應(yīng)的水解酶，因而不能被直接消化利用。有研究表明，大蒜果聚糖可作為乳酸菌發(fā)酵的碳源，應(yīng)用于低鹽發(fā)酵的漁產(chǎn)品中，并能增殖乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸［2］。在中國，大蒜傳統(tǒng)上就有預(yù)防和治療腸道疾病的功效，我們的前期研究也表明大蒜果聚糖能選擇性增殖腸道益生菌，具有開發(fā)成新型益生元的潛力［3］。

短鏈脂肪酸是非消化性碳水化合物被結(jié)腸微生發(fā)酵后的主要代謝產(chǎn)物。短鏈脂肪酸對人體健康有重要意義，它們提供給機體部分能量(約每日膳食總能量的10%左右)，維持腸粘膜細胞的能量供給，作為微生物代謝的能源，增加腸道血流量，刺激胃腸激素生成等生理功能。此外，對病理狀態(tài)下的腸道有改善作用，如能促使水、鹽重吸收，預(yù)防結(jié)腸癌等。尤其丁酸，為腸道上皮細胞提供能量，對改善人體腸道健康有著極其重要的作用［4-5］。通過測定發(fā)酵基質(zhì)中短鏈脂肪酸的水平可以全面性地評價體系中厭氧菌的變化情況，短鏈脂肪酸的含量也可以反應(yīng)腸道細菌的活性［6］，因此，短鏈脂肪酸的分析對進一步評價大蒜果聚糖對腸道微生態(tài)的影響有重要意義。本文主要研究了聚合度為11(樣 a)、16(樣 b)、21(樣 c)的三個大蒜果聚糖樣品，接種健康成人糞便懸浮液，體外模擬人體腸道pH、溫度及營養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)24h，進行產(chǎn)短鏈脂肪酸的研究，并以無碳源培養(yǎng)基為陰性對照，以添加葡萄糖、菊糖培養(yǎng)基為陽性對照。

1 材料與方法

1.1 大蒜果聚糖的制備

從市售大蒜中采用酒精分步沉淀制備大蒜果聚糖，其平均分子量采用DNS法和離子色譜法測定［7］。

表1 大蒜果聚糖各樣品的平均分子質(zhì)量及平均聚合度Table 1 Average molecular mass and degree of polymerization of garlic fructans

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基［8］

以大蒜果聚糖為唯一碳源，蛋白胨2，酵母浸膏2，NaCl 0.1，K2HPO40.04，KH2PO40.04，MgSO4·7H2O 0.01，CaCl2·2H2O 0.01，NaHCO32，Tween-80 2mL，氯化血紅素 5 mg，VK140 μL，L-半胱氨酸鹽酸鹽10.5，膽汁酸鹽 0.5，pH 6.7。陽性對照碳源:菊糖(果糖含量為93.2%，平均分子量為5 800 Da)比利時Orafti公司;另一陽性對照采用葡萄糖為碳源;陰性對照無碳源。每個樣品3個平行實驗。

1.3 發(fā)酵菌源

以健康成人的糞便作為發(fā)酵菌源，要求參加實驗的志愿者一個月內(nèi)未服用抗生素，且無腸胃病史。

1.4 短鏈脂肪酸的測定

將-20℃保存的各個時間點的發(fā)酵液樣品于常溫下10 000 r/min，離心10 min，去除菌體和沉淀物。取上清液用0.45 μm濾膜過濾后，采用安捷倫液相色譜系統(tǒng)，進樣分析，測定發(fā)酵液樣品中乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸的含量，每個樣品測定重復(fù)3次。圖1為乳酸、乙酸、丙酸、丁酸標準品的液相色譜圖。

圖1 乳酸、乙酸、丙酸、丁酸標準品的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograph of lactic acid，acetic acid，propionic acid and butyric acid

HPLC分析條件:色譜柱:Agilent反向C18柱(4.6 mm ×150 mm，5μm);流動相:0.02 mol/mL KH2PO4(H3PO4調(diào)pH值為2.8±0.05)∶甲醇(體積比98∶2，v/v);檢測波長:215 nm;流速:1.0 mL/min;進樣體積:20 μL。

1.5 統(tǒng)計方法

采用 SPSS13.0軟件包(SPSS Inc.，chicago，USA)進行數(shù)據(jù)分析，用配對設(shè)計樣本的均數(shù)比較、方差分析做差異的顯著性檢驗，P＜0.05差異顯著。

2 實驗結(jié)果

2.1 發(fā)酵液中總短鏈脂肪酸含量的變化

圖2是體外發(fā)酵體系24 h內(nèi)總鏈脂肪酸(總短鏈脂肪酸為乙酸、丙酸、丁酸和乳酸之和)的變化，0 h時各樣品培養(yǎng)基中的總短鏈脂肪酸含量無顯著差異(P＞0.05)。發(fā)酵至4h時，大蒜果聚糖樣a培養(yǎng)基中的總短鏈脂肪酸含量最高，為61.8μmol/mL，顯著高于陽性對照——菊糖(P＜0.05)，樣b和樣c則低于樣a，但不存在顯著差異。大蒜果聚糖樣品培養(yǎng)基在發(fā)酵12h時產(chǎn)生的短鏈脂肪酸量達最高值，且樣a＞樣 b＞樣 c，其 SCFA含量分別為86.38、83.59、51.92 μmol/mL，顯著高于菊糖培養(yǎng)基中短鏈脂肪酸含量(P＜0.05)。

圖2 總短鏈脂肪酸在24 h體外發(fā)酵期間的變化Fig.2 Changes of total short chain fatty acids during 24h in vitro fermentation

2.2 發(fā)酵液中乙酸含量的變化

圖3 顯示，0 h時，大蒜果聚糖樣品中初始乙酸含量較高，但與其他各樣沒有顯著差別(P＞0.05)。4 h時，大蒜果聚糖樣品發(fā)酵液中乙酸含量均達到各時段的最高值，分別為 14.5、10.38、8.56 μmol/mL，顯著高于4h時葡萄糖和菊糖培養(yǎng)基中乙酸的含量(P＜0.05)。發(fā)酵至8 h時，乙酸含量有所下降，但在12 h有一定的提高，其中樣 a的含量增加至11.84 μmol/mL，并在24 h 時含量仍較高(9.43 μmol/mL)。

圖3 乙酸在24 h體外發(fā)酵期間的變化Fig.3 Changes of acetic acids during 24 h in vitro fermentation

2.3 發(fā)酵液中丙酸含量的變化

各樣品發(fā)酵液中丙酸含量相對較低，但各時段含量較穩(wěn)定(見圖4)。發(fā)酵4 h時，大蒜果聚糖樣a中丙酸含量降至0.82 μmol/mL，顯著低于其他各樣(P＜0.05)，且在8～24 h時，其含量維持在3～5 μmol/mL。大蒜果聚糖樣b和樣c培養(yǎng)基中丙酸含量較樣a高，以樣c的含量最高(11.08 μmol/mL)，但樣品間丙酸含量沒有顯著差別(P＞0.05)。

2.4 發(fā)酵液中丁酸含量的變化

圖4 丙酸在24 h體外發(fā)酵期間的變化Fig.4 Changes of propionic acids during 24 h in vitro fermentation

人體腸道微生物代謝產(chǎn)生的丁酸含量較高。隨發(fā)酵時間延長，發(fā)酵液中的丁酸不斷積累，至發(fā)酵24 h時，丁酸含量積累達到最高。由圖5可見，發(fā)酵各時間段，大蒜果聚糖樣品中微生物代謝產(chǎn)生的丁酸量明顯高于陽性對照——菊糖，8、12、24 h，均以大蒜果聚糖樣 a的丁酸產(chǎn)生量最高，濃度依次為24.5、25.47、30.81 μmol/mL。

圖5 丁酸在24 h體外發(fā)酵期間的變化Fig.5 Changes of butyric acids during 24 h in vitro fermentation

2.5 發(fā)酵液中乳酸含量的變化

圖6 乳酸在24 h體外發(fā)酵期間的變化Fig.6 Changes of lactic acids during 24 h in vitro fermentation

由圖6可知，大蒜果聚糖經(jīng)糞便微生物厭氧代謝后產(chǎn)生的乳酸含量明顯高于空白和陽性對照——菊糖。大蒜果聚糖樣a和樣b中乳酸產(chǎn)生量高于樣c，但無顯著性差別。12 h時，樣b培養(yǎng)基中的乳酸含量最高，其次是樣a，發(fā)酵至24 h時，樣a培養(yǎng)基中的乳酸含量最高，為42.0 μmol/mL，樣b和樣c的乳酸含量較低，分別為 28.75、22.85 μmol/mL(P ＜0.05)。

3 討論

研究表明，腸道微生物可以利用大蒜果聚糖產(chǎn)短鏈脂肪酸?？瞻椎臉悠分袡z測到了短鏈脂肪酸，這可能是與糞便懸浮液中殘存的未消化碳水化合物有關(guān)。

除陰性對照，各培養(yǎng)液均在12 h短鏈脂肪酸的產(chǎn)量最高，至24 h含量均有一定程度下降，這說明發(fā)酵至后期，培養(yǎng)基中產(chǎn)生的短鏈脂肪酸部分被微生物利用，用于其自身增殖。接種不同受試者糞便發(fā)酵后，腸道微生物代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸數(shù)量有很大差異?？赡苁怯捎诟鱾€受試者的體質(zhì)狀況和飲食習慣各不相同，腸道微生物組成比例和數(shù)量都會有很大差異，從而利用大蒜果聚糖產(chǎn)生短鏈脂肪酸的數(shù)量和比例也會有很大差異。

比較各培養(yǎng)液中乙酸、丙酸、丁酸和乳酸的摩爾比發(fā)現(xiàn)，大蒜果聚糖和菊糖培養(yǎng)液中丁酸和乳酸的摩爾濃度高于乙酸和丙酸。Gibson等人報道菊糖24 h體外發(fā)酵的摩爾比為乙酸∶丙酸∶丁酸 =72∶19∶8［9］。Stewart等人的研究則表明，菊糖果聚糖(90% ～94%DP＞10;6% ～10%DP=1-2)體外發(fā)酵的摩爾比為乙酸∶丙酸∶丁酸 =66∶10∶24［10］。Hernot等人發(fā)現(xiàn)，果聚糖體外發(fā)酵12 h時，丁酸的摩爾比非常高，乙酸∶丙酸∶丁酸為55∶15∶30(短鏈果聚糖)及45∶13∶42(長鏈果聚糖)［11］。由此可見，不同的發(fā)酵體系以及不同聚合度的樣品得到的摩爾比有較大差異。

Stewart等［10］和 Velaquez等［12］的研究均發(fā)現(xiàn)，低聚合度的果聚糖被代謝產(chǎn)生總SCFA的速度較高聚合度的果聚糖快，聚合度為10左右的果聚糖發(fā)酵12h時總SCFA產(chǎn)量達到最高，至發(fā)酵24h時，SCFA含量呈下降趨勢，這與我們的研究結(jié)果類似，大蒜果聚糖樣品a(DP11)，產(chǎn)酸高于樣b和c(DP 16和20)。由于菊糖是直鏈果聚糖，大蒜果聚糖是帶支鏈的，因此兩者之間不能簡單比較。

大蒜果聚糖能被人體腸道微生物發(fā)酵利用在體外產(chǎn)短鏈脂肪酸。其中丁酸和乳酸的摩爾濃度較乙酸和丙酸高。聚合度低的大蒜果聚糖產(chǎn)酸高于聚合度高的果聚糖。

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