韓梅，翟玉貴，王小波，張偉國

1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇無錫，214122)

2(光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，上海，200436)

類胡蘿卜素是一類在植物、動物和微生物中廣泛存在的脂溶性色素，已被廣泛地應(yīng)用于藥物，保健品，動物飼料和化妝品的生產(chǎn)［1-2］。它們不僅可以作為維生素A源，還可以有效地保護(hù)細(xì)胞中的各種生物大分子不受自由基的損傷，從而維持細(xì)胞正常的生理代謝，防止衰老和癌變［3-5］。海洋紅酵母因其含有豐富的類胡蘿卜素、不飽和脂肪酸等，現(xiàn)在已經(jīng)作為一種益生菌應(yīng)用于海產(chǎn)品養(yǎng)殖，它既可以作為魚類的餌料為其提供各種營養(yǎng)物質(zhì)和類胡蘿卜素，又可以附著在魚鱗上防止其他有害細(xì)菌的滋生，提高魚類的存活率［6］，紅酵母既可以作為有益微生物與海洋生物共生，又可以作為菌體蛋白應(yīng)用于功能飼料的開發(fā)。隨著畜牧業(yè)和飼料業(yè)的迅猛發(fā)展，飼料添加劑也向著廣度和深度方向發(fā)展?，F(xiàn)在很多國家和地區(qū)都在加大對飼料添加劑的研發(fā)，其中美國、日本和歐盟等已有100多種飼料添加劑產(chǎn)品，隨著飼料添加劑的運(yùn)用，其在養(yǎng)殖業(yè)中的作用越來越顯著。

從目前來看，隨著人們對合成色素毒性的認(rèn)識程度的加深，許多國家已禁止使用毒性較大的化學(xué)合成色素，轉(zhuǎn)為使用天然的微生物、植物和動物產(chǎn)品。受資源和環(huán)境等條件的限制，天然動植物增色飼料添加劑的發(fā)展空間受到制約。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)增色飼料添加劑將是發(fā)展的必然趨勢。增色飼料添加劑的研究與應(yīng)用已取得初步進(jìn)展，本論從篩選高產(chǎn)類胡蘿卜素的菌種出發(fā)，選育出1株類胡蘿卜素產(chǎn)量遠(yuǎn)高于市售海洋紅酵母的鎖擲酵母，現(xiàn)對其含有的類胡蘿卜素，氨基酸和脂肪酸進(jìn)行分析，為其應(yīng)用于飼料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

鎖擲酵母(Sporidiobolus pararoseus)JD-2從自然界中篩選并保藏于中國典型菌種保藏中心，保藏號:CCTCC M 2010326。

海洋紅酵母(Rhodotorula sp.)，購于安琪酵母。

1.2 主要試劑和儀器

β-胡蘿卜素，番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品購自SIGMA;

高效液相色譜儀購自美國安捷倫公司。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，瓊脂 20 g/L，pH6。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，玉米漿20 g/L，Mg-SO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，pH6。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖40 g/L，玉米漿20 g/L，Mg-SO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，pH6。

1.4 實(shí)驗方法

搖瓶培養(yǎng)方法:將菌株接入種子培養(yǎng)基中，待其長到對數(shù)生長期后期，再以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃下、100 r/min的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)72 h。

7 L罐分批發(fā)酵培養(yǎng)方法:發(fā)酵罐中裝液量3.5 L，接種量10%，通風(fēng)1 L/min，流加氨水控制pH6左右，通過流加泡敵消泡，根據(jù)溶氧需求調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，發(fā)酵72 h。

1.5 菌體的獲得

發(fā)酵液→5 000 r/min離心10 min→菌體→同體積的蒸餾水洗2次→冷凍干燥備用

1.6 分析方法

1.6.1 類胡蘿卜素分析

將薄板上基本分離的色素刮下，溶于丙酮中進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

C18柱分離條件:①流動相:V(乙腈)∶V(二氯甲烷)=1∶1;②流速1 mL/min;③進(jìn)樣量10 μL;④檢測波長470 nm;⑤柱溫30℃;⑥色譜柱:d 3.9 mm×150 mm Nova-Pak C18，顆粒直徑 5 μm。

C30柱同分異構(gòu)體分離條件［7-8］:①色譜柱:Warotenoid S-5(4.6 mm×250 mm);②流動相A為乙腈-甲醇(體稷比75∶25)，流動相B為甲基叔丁基醚，流動相A和B中分別加入體積分?jǐn)?shù)為0.05%的三乙胺;③線性梯度洗脫:流動相B在8 min內(nèi)由0%增加到55%;8～35 min內(nèi) B維持55%;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量 20 μL。

1.6.2 氨基酸分析方法

分別用酸法和堿法水解后用氨基酸自動分析儀測定。

1.6.3 脂肪酸的測定方法

菌體破壁后用丙酮提取的粗類胡蘿卜素提取液于80℃烘箱中烘6 h，得粗脂肪，甲酯化后，用氣相色譜法測定。

氣相色譜法測定條件:起始溫度150℃，保持3 min，升溫速率3℃/min，至240℃，保留20 min。載氣壓力(N2):0.060 MPa;燃?xì)鈮毫?H2):0.65 MPa;助燃?xì)鈮毫?空氣):0.050 MPa;分流比:30∶1。

2 結(jié)果與討論

2.1 海洋紅酵母與鎖擲酵母中總類胡蘿卜素含量的比較

由圖1可知，鎖擲酵母中總類胡蘿卜素的含量明顯大于海洋紅酵母。海洋紅酵母菌體和凍干粉呈粉紅色，鎖擲酵母菌體和凍干粉呈深紅色。鎖擲酵母可以作為一種增色飼料添加劑應(yīng)用于功能性飼料的開發(fā)。增色飼料添加劑是增加畜、禽蛋、禽肉和水產(chǎn)品色澤的添加劑。動物體本身不能合成類胡蘿卜素，必須由飼料供給，飼料中的類胡蘿卜素被吸收后，沉著于畜禽和海產(chǎn)品中使之著色。禽蛋的卵黃，禽類皮膚與肉質(zhì)和海產(chǎn)品的外殼與肉質(zhì)的色澤在一定程度上決定了它們的商品價值。但是隨著飼料行業(yè)的發(fā)展，飼養(yǎng)周期的縮短，它們的色澤與自然生長的產(chǎn)品差距越來越大，人們可以在飼料中添加一定比例的增色劑，解決由于飼養(yǎng)時間縮短引起的色澤不足問題，這是提高畜禽產(chǎn)品質(zhì)量的重要技術(shù)措施之一。國內(nèi)外大量研究表明，通過合理調(diào)整飼料的營養(yǎng)成分可提高畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量［9］，其富含的類胡蘿卜素還可以通過食物鏈被動物吸收，提高產(chǎn)品品質(zhì)。另外作為菌體飼料，鎖擲酵母還可以為動物提供豐富的氨基酸和脂肪酸。

圖1 海洋紅酵母與鎖擲酵母總類胡蘿卜素的比較(平板比較圖和凍干粉比較圖)Fig.1 The comparation of carotenoids in Sporidiobolus pararoseus JD-2 and Rhodotorula sp.

2.2 鎖擲酵母中各種類胡蘿卜素的分析

圖2 薄板層析圖和C18柱液相色譜圖Fig.2 The thin layer chromatography and HPLC used C18

由圖2和圖3、表1可知，色素1的出峰時間與β-胡蘿卜素標(biāo)樣相同，并且質(zhì)譜分析其分子質(zhì)量為536，色素1的最大吸收峰在450 nm處，所以可以確定其為β-胡蘿卜素;色素2的出峰時間介于β-胡蘿卜素和番茄紅素之間但是更接近于番茄紅素，其分子質(zhì)量為534確定其為紅酵母烯;色素3的分子質(zhì)量為564，確定其為紅酵母紅素，它的分子末端含有一個羧基，可溶于堿性的醇溶液中;色素4的分子質(zhì)量為536，其最大吸收峰與γ-胡蘿卜素接近，出峰位置介于β-胡蘿卜素和番茄紅素之間，更接近β-胡蘿卜素，所以可以初步確定其為γ-胡蘿卜素。由表2可知，鎖擲酵母中含有的總類胡蘿卜素量顯著高于海洋紅酵母，并且其中含有較多的β-胡蘿卜素，而海洋紅酵母中β-胡蘿卜素含量很少，以紅酵母烯為主。

圖3 類胡蘿卜素質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrogram of carotenoids

表1 鎖擲酵母發(fā)酵產(chǎn)物中可能存在的類胡蘿卜素種類及色譜特征Table 1 Carotenoids chromatographic characteristics in the fermentation production of Sporidiobolus pararoseus JD－2

表2 海洋紅酵母和鎖擲酵母中類胡蘿卜素組成Table 2 Carotenoids composition of Rhodotorula sp．a(chǎn)nd Sporidiobolus pararoseus JD－2

由于類胡蘿卜素類物質(zhì)的碳骨架是由單雙鍵交替的長多烯鏈構(gòu)成，所以它有多種順反異構(gòu)體，研究表明，動物和人對不同的異構(gòu)體的利用程度是不同的，因此分析各種類胡蘿卜素的順反異構(gòu)情況有一定的意義。在人體血液中全反式β-胡蘿卜素占90%左右，順式結(jié)構(gòu)幾乎只有13-順-β-胡蘿卜素，但是在人體組織中全反式β-胡蘿卜素只有70% ～80%，順式結(jié)構(gòu)主要有9-順和13-順-β-胡蘿卜素，并且順式結(jié)構(gòu)的含量在不同的組織中含量有區(qū)別［10-11］。全反式β-胡蘿卜素有較高的維生素A轉(zhuǎn)化功能［12］，而其他的順式結(jié)構(gòu)對組織的功能性有更重要的作用［10］。

圖4 天然與合成β-胡蘿卜素的液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of natural and synthetic β-carotene

圖5 β-胡蘿卜素的光譜特征圖Fig.5 Spectral overlays of β-carotene sample

根據(jù)β-胡蘿卜素的液相色譜圖4、光譜特征圖5和參考文獻(xiàn)［7］對β-胡蘿卜素同分異構(gòu)體進(jìn)行分析，結(jié)果得出鎖擲酵母中β-胡蘿卜素異構(gòu)體以全反式β-胡蘿卜素(1-2)為主，占總β-胡蘿卜素的60%左右，順式結(jié)構(gòu)主要有13-順(1-1)和9-順β-胡蘿卜素(1-3)，分別占21%和10%，而化學(xué)合成的β-胡蘿卜素幾乎全為全反式β-胡蘿卜素。

2.3 海洋紅酵母和鎖擲酵母中的氨基酸組成

由表3氨基酸分析可知鎖擲酵母中的蛋白質(zhì)含量占總干重的15%左右，其氨基酸組成中必需氨基酸占總氨基酸的38%，而且必需氨基酸種類全面，鮮味氨基酸占總氨基酸的43%，可以很好的促進(jìn)魚類的進(jìn)食。鎖擲酵母與海洋紅酵母的氨基酸組成基本類似。

2.4 海洋紅酵母和鎖擲酵母中的脂肪酸組成

不飽和脂肪酸能使動物血清中總膽固醇、低密度脂蛋白-膽固醇三酰甘油水平均下降而且可以提高畜禽免疫力［13］。油酸能夠降低膽固醇在血液中的含量，減少其在血管上的沉積，有預(yù)防動脈硬化等作用，同時油酸卻不降低有益膽固醇的含量。營養(yǎng)界把油酸稱為“安全脂肪酸”，油酸的含量多少，是評定食用油品質(zhì)的重要標(biāo)志。亞油酸是動物生長的必需有機(jī)酸之一，是合成n-6系列不飽和脂肪酸的前體物質(zhì)。由圖6和表4可知海洋紅酵母中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的76%左右，鎖擲酵母中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的74%左右，酵母菌體可以很好地改變畜禽的飼料結(jié)構(gòu)，不僅可以提高畜禽的質(zhì)量，還有可能通過食物鏈的作用提高人體機(jī)能。

表3 海洋紅酵母和鎖擲酵母中氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of Rhodotorula sp．a(chǎn)nd Sporidiobolus pararoseus JD-2

圖6 海洋紅酵母和鎖擲酵母中脂肪酸組成Fig.6 Fatty acids composition of Rhodotorula sp.and Sporidiobolus pararoseus JD-2

表4 海洋紅酵母和鎖擲酵母中脂肪酸組成Table 4 Fatty acids composition of Rhodotorula sp．a(chǎn)nd Sporidiobolus pararoseus JD－2

3 結(jié)語

本實(shí)驗研究了鎖擲酵母中主要的類胡蘿卜素組成，并且對其β-胡蘿卜素的同分異構(gòu)體進(jìn)行了分析，為其作為增色飼料添加劑奠定了基礎(chǔ)。又進(jìn)一步分析了鎖擲酵母中氨基酸、脂肪酸的組成，并且將各指標(biāo)與現(xiàn)有的市售海洋紅酵母進(jìn)行了比較分析，確定了鎖擲酵母作為飼料酵母的可行性，為鎖擲酵母的深入應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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