姚明澤，盧文亮，張耀華，梁愛華*

(山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006)

植酸酶是催化植酸及其鹽類水解成肌醇和磷酸的一類酶的總稱，可降低飼料中植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高單胃動(dòng)物磷的吸收率，降低磷的污染，目前在食品特別是飼料領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[1-2]。植酸酶廣泛存在于自然界的動(dòng)物、植物和微生物組織中。按照三維結(jié)構(gòu)和生化特點(diǎn)的不同，目前植酸酶可以分為三大類：組氨酸酸性磷酸酶植酸酶(histidine acid phosphatases，HAPs)、β-螺旋槳植酸酶(β-propeller phytases，BPPs)、半胱氨酸磷酸酶植酸酶或紫色酸性磷酸酶植酸酶(purple acid phosphatases，PAPs)[3-4]。其中，BPPs有時(shí)也被稱為β-折疊桶磷酸酶或中性植酸酶。BPPs主要來源于芽孢桿菌。芽孢桿菌生產(chǎn)植酸酶可以促進(jìn)農(nóng)作物和植物根部吸收無機(jī)磷或植酸，而被稱作“植物生長(zhǎng)促進(jìn)細(xì)菌”(PGPR)，如解淀粉芽孢桿菌[5]。從作物根部分離產(chǎn)植酸酶的芽孢桿菌，從而獲得中性植酸酶基因，開展植酸酶的研究是目前研究植酸酶的一種途徑[6]。

目前，對(duì)β-螺旋槳植酸酶研究數(shù)據(jù)還比較少，然而β-螺旋槳植酸酶可能是自然界中分布最廣的一類植酸酶，在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中有良好應(yīng)用前景[7]。為了獲得新的產(chǎn)β-螺旋槳植酸酶菌株，并開展中性植酸酶結(jié)構(gòu)與功能的研究，本研究從大豆根部土壤微生物中進(jìn)行篩選，獲得兩株產(chǎn)植酸酶的芽孢桿菌，并對(duì)其進(jìn)行16S rRNA鑒定。對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，通過PCR技術(shù)獲得2株芽孢桿菌植酸酶基因的完整開放閱讀框，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。為進(jìn)一步探討中性植酸酶的結(jié)構(gòu)與功能以及植酸酶的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

土樣取自山西運(yùn)城植物大豆根際距地表0.5cm的土壤，利用活性檢測(cè)方法分離得到兩株芽孢桿菌，用于克隆的大腸肝菌菌株E.coli DH5α保存在本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑

Taq酶、pMD-18T、DNA Marker(DL2000) 日本TaKaRa公司；膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒 美國(guó)Biomiga公司；植酸鈣 東京化成工業(yè)公司；植酸鈉 美國(guó)Promega公司；酵母表達(dá)載體pPIC9 本實(shí)驗(yàn)室保存；其他試劑都為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：瓊脂15、蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10，pH 7.4；LPM 液體培養(yǎng)基：NaCl 5、葡萄糖4、CaCl23.34、MgSO41.72、MgCl21.62、酪蛋白胨1、KCl 0.54、谷氨酸0.5、大豆蛋白胨0.45，pH 7.0；PSM固體培養(yǎng)基(g/L)[8]：葡萄糖20、植酸鈣2、NH4NO35、KCl 0.5、CaCl22、MgSO4·7H2O 0.5、MnSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、瓊脂糖15，pH 7.0。

1.4 方法

1.4.1 土壤中產(chǎn)植酸酶芽孢桿菌篩選與16S rRNA鑒定

將從不同地方采集的土樣各1g分別溶于10mL的滅菌蒸餾水中，充分振蕩后置于85℃的水浴鍋內(nèi)加熱15min，靜置過夜放大培養(yǎng)，取該培養(yǎng)液0.5mL涂布LB固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取菌落轉(zhuǎn)接于PSM固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2～3d，挑取產(chǎn)生透明圈的菌落。

16S rRNA鑒定：用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取所要鑒定細(xì)菌基因組，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物Forward primer 8～27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，Reverse primer 1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為：94℃、45s；52℃、45s；72℃、1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并使用膠回收試劑盒回收純化。最后，純化回收產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.2 菌株粗酶液酶活力的測(cè)定

將100mL發(fā)酵產(chǎn)物12000r/min離心10min，取出上清獲得粗酶液進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。取 0.2mL上清粗酶液，加入0.8mL 6.25mmol/L的植酸鈉(用含1mmol/L CaCl2的0.1mmol/L Tris-HCl (pH7.0)配制)，37℃保溫15min，加入1mL 5% TCA終止酶活反應(yīng)，然后加入1mL硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色液，700nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度以計(jì)算出無機(jī)磷含量。對(duì)照為先在0.2mL的粗酶液中加入1mL TCA使酶滅活，再加入同體積的底物保溫。酶活力單位(U)定義為：在一定條件下，每分鐘釋放出1μmol無機(jī)磷所需的酶量為一個(gè)酶活性單位。所有酶活測(cè)定數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

1.4.3 菌株粗酶液酶學(xué)性質(zhì)

1.4.3.1 酶的最適反應(yīng)pH值

粗酶液在37℃、不同的pH值條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)測(cè)定其最適pH值。底物植酸鈉用不同pH值的含1mmol/L CaCl2的0.2mmol/L緩沖液配制(pH4.0、5.0為HAc-NaAc緩沖液；pH 6.0、7.0、8.0為Tris-HCl緩沖液)。

1.4.3.2 酶的最適反應(yīng)溫度

粗酶液在 Tris-HCl(pH 7.0)含1mmol/L CaCl2緩沖液體系及不同溫度(30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃)下進(jìn)行酶促反應(yīng)。

1.4.3.3 Ca2+對(duì)酶活性的影響

粗酶液在Tris-HCl(pH7.0)中0.03mmol/L和1mmol/L CaCl2濃度條件下分別在60℃與65℃進(jìn)行酶促反應(yīng)測(cè)定。

1.4.4 菌生長(zhǎng)密度和相對(duì)產(chǎn)酶量的關(guān)系

分別挑取兩株菌的單克隆到5mL LB培養(yǎng)基中30℃過夜培養(yǎng)，按照0.5%轉(zhuǎn)接到100mL LPM培養(yǎng)基中表達(dá)。每12h取培養(yǎng)液測(cè)定酶活和OD600nm值。

1.4.5 植酸酶基因的擴(kuò)增

中性植酸酶序列的擴(kuò)增：使用細(xì)菌基因組提取試劑盒，對(duì)所篩選出的兩株芽孢桿菌進(jìn)行基因組DNA提取。根據(jù)GenBank報(bào)道的Bacillus的序列，參考已報(bào)道[6]芽孢桿菌基因起始密碼子和終止密碼子兩側(cè)序列，設(shè)計(jì)引物：F-up：5’-AGTGATAAAAGAGGAGG-3’，R-down：5’-GCTGCACAAGCTGCTTTC-3’，由生工生物工程(上海)有限公司合成。以提取的基因組為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增中性植酸酶基因開放閱讀框。反應(yīng)參數(shù)為：94℃、45s，47℃、45s，72℃、1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用膠回收試劑盒回收純化。將4μL回收純化產(chǎn)物與1μL pMD-18T克隆載體反應(yīng)體系中加5μL SolutionⅠ過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒并送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.6 SWISS-MODEL對(duì)Phy(ycD)和 Phy(ycE)建模分析

去除了信號(hào)肽的Phy(ycD)和Phy(ycE)運(yùn)用SWISSMODEL服務(wù)器(http：//swissmodel.expasy.org/)同源建模，采用晶體結(jié)構(gòu)(PDB DOI：10.2210)為模板。運(yùn)用軟件Spdbv對(duì)同源模型的4個(gè)不同氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)植酸酶菌株的篩選與16S rRNA鑒定結(jié)果

挑取分離得到的單菌落，在液體培養(yǎng)基30℃過夜培養(yǎng)后，在含有植酸鈣的PSM固體培養(yǎng)基上劃線，可以明顯看到在菌落的附近有水解圈的產(chǎn)生(圖1)。并且通過鏡檢觀察到細(xì)菌芽孢為無色，橢圓形，芽孢位置居中或端生，菌體為紅紫色?？梢源_定經(jīng)培養(yǎng)得到的微生物是芽孢桿菌[9]。16S rRNA測(cè)序結(jié)果為1200bp左右，與GenBank已報(bào)道的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與枯草芽孢桿菌的16S核苷酸同源性為100%，因此認(rèn)為分離的兩株細(xì)菌為枯草芽孢桿菌。分別命名為Bacillus sp. YCD、YCE。

圖 1 芽孢桿菌YCD(a)和YCE(b)在PSM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)產(chǎn)生水解圈Fig.1 Transparent circles of the Bacillus subtilis isoaltes on PSM

2.2 菌株粗酶液酶學(xué)性質(zhì)的初步測(cè)定

2.2.1 酶的最適反應(yīng)pH值

圖 2 粗酶液中植酸酶的最適pH值Fig.2 Optimal pH of phytase in cell lysate

在37℃不同pH值的緩沖液中對(duì)兩株芽孢桿菌粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定，由圖2可知，phy(ycD)、phy(ycE)最適pH值都在7.0左右，而當(dāng)pH 4.5時(shí)，殘余酶活力不到10%。與以往報(bào)道[6]的芽孢桿菌植酸酶相比殘余酶活力低，推測(cè)是因?yàn)檠挎邨U菌表達(dá)粗酶液中植酸酶的含量低的緣故。

2.2.2 酶的最適反應(yīng)溫度

圖 3 粗酶液中植酸酶的最適溫度Fig.3 Optimal temperature of phytase in cell lysate

在不同溫度下測(cè)定其酶活，由圖3可知，60℃時(shí)，phy(ycD)、phy(ycE)植酸酶酶活力達(dá)到最大，phy(ycE)相對(duì)酶活力高于phy(ycD)的酶活力。

2.2.3 Ca2+對(duì)表達(dá)產(chǎn)物酶活性的影響

圖 4 Ca2+對(duì)酶活性的影響Fig.4 Effects of Ca2+ on phytase activity

以前有文獻(xiàn)報(bào)道[10-12]來源于Bacillus subtilis的植酸酶，有Ca2+依賴性，在含有不同Ca2+濃度的緩沖液中，在60℃對(duì)2株芽孢桿菌植酸酶活性進(jìn)行測(cè)定，由圖4可知，含有1mmol/L Ca2+的緩沖液測(cè)定的相對(duì)酶活力明顯高于含有0.03mmol/L Ca2+的緩沖液測(cè)定的值。表明分離的這2株菌株的植酸酶酶學(xué)性質(zhì)受Ca2+的影響。

2.3 菌生長(zhǎng)密度和相對(duì)產(chǎn)酶量的關(guān)系

為了研究菌生長(zhǎng)密度和產(chǎn)酶量之間的關(guān)系，將2株芽孢桿菌轉(zhuǎn)接到LPM培養(yǎng)基中表達(dá)，由圖5可知，約20h后兩株芽孢桿菌生長(zhǎng)密度達(dá)到最大，Bacillus sp. YCE的OD600nm值大于Bacillus sp.YCD的OD600nm值。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)酶的表達(dá)量不斷增長(zhǎng)，到達(dá)120h時(shí)，Bacillus sp. YCE的表達(dá)量不再升高，而Bacillus sp.YCD的表達(dá)量還有升高趨勢(shì)。可能是隨著時(shí)間的推移，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，次生代謝產(chǎn)物增多，菌已不再增長(zhǎng)，但是還在向培養(yǎng)液中分泌植酸酶。

圖 5 芽孢桿菌菌體YCE(a)和YCD(b)生長(zhǎng)與相對(duì)產(chǎn)酶量Fig.5 Growth curve and phytase yield of Bacillus sp.YCD and Bacillus sp.YCE

2.4 植酸酶基因的擴(kuò)增

圖 6 植酸酶基因phy(ycD)和phy(ycE) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.6 Electrophoresis of PCR products of phy(ycE) and phy(ycD)

分別以分離得到的兩株Bacillus subtilis基因組DNA為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增目的基因。PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖6。PCR 產(chǎn)物為1.1kb的單一條帶，片段大小與預(yù)期相符合。序列分析表明，從2個(gè)菌株中獲得的序列不完全相同，分別命名為phy(ycD)和phy(ycE)。其中phy(ycE)序列已提交GenBank(序列登錄號(hào)為JQ257502)，所產(chǎn)植酸酶屬于中性植酸酶。根據(jù)Signal P3.0信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件分析，N端的26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在+26位的Ala之后。

phy(ycD)和phy(ycE)核苷酸序列一致性為98%，氨基酸序列上有5個(gè)氨基酸不同。phy(ycE)與基因庫(kù)中已登錄的中性植酸酶基因(DQ346196.1、DQ346195.1、EF536824.1)的核苷酸序列一致性在90%以上，但是通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的這3個(gè)中性植酸酶3個(gè)位點(diǎn)(S161、A344、E363)完全相同，而與本實(shí)驗(yàn)分離的phy(ycE)不同，phy(ycE)中這3個(gè)位點(diǎn)分別為(G161、T344、G363)。特別是363這個(gè)位點(diǎn)由酸性氨基酸谷氨酸變?yōu)楦拾彼?，這可能會(huì)造成酶學(xué)性質(zhì)差異。而phy(ycD)與基因庫(kù)中已登錄的中性植酸酶基因的序列最高同源性達(dá)到100%。

2.5 phy(ycD)、phy(ycE)同源建模分析

從大豆根部分離2株芽孢桿菌菌株，克隆出2個(gè)中性植酸酶基因phy(ycD)、phy(ycE)，成熟蛋白有4個(gè)氨基酸不同，酶學(xué)性質(zhì)也有差異，4個(gè)氨基酸造成了酶學(xué)性質(zhì)的差異，通過同源建模，Spdbv軟件分析，4個(gè)氨基酸(phy(ycD)/147N、161S、344A、363E，phy(ycE)/147K、161G、344T、363G)位所處的二級(jí)結(jié)構(gòu)位置都不同，如圖7中方框所示，依次分別位于酶分子的“Loop”結(jié)構(gòu)，酶分子內(nèi)部β-折疊片層結(jié)構(gòu)，反向的β-折疊片層結(jié)構(gòu)，以及α-螺旋結(jié)構(gòu)的末尾。圖中紅色圓點(diǎn)代表Ca2+。

圖 7 植酸酶phy(ycD)、phy(ycE)的同源建模Fig.7 Homology structure modeling and analysis of phytase phy(ycD) and phy(ycE)

3 討 論

芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)微生物種群之一，具有很強(qiáng)的抗逆能力和抑菌防病增產(chǎn)作用。有報(bào)道稱很多細(xì)菌生長(zhǎng)在植物根部幫助植物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中許多芽孢桿菌能產(chǎn)中性植酸酶[5,13-14]。來源于其他微生物的中性植酸酶也有報(bào)道，如Janthinobacterium sp.[15]。芽孢桿菌植酸酶有高的熱穩(wěn)定性，最適pH值接近中性約在7.0～8.0之間。

本研究從運(yùn)城大豆根部土壤分離出2株產(chǎn)植酸酶芽孢桿菌，并且克隆出2個(gè)中性植酸酶基因，從編碼中性植酸酶的結(jié)構(gòu)基因來看，它們與以往分離到的酸性植酸酶基因均無同源性，這2個(gè)中性植酸酶基因phy(ycD)和phy(ycE)核苷酸序列一致性為98%，氨基酸序列上有5個(gè)不同，其中1個(gè)位于信號(hào)肽內(nèi)，另外4個(gè)位于成熟肽中，而第147位的氨基酸處在“Loop”結(jié)構(gòu)上，它附近有個(gè)Ca2+，此Ca2+結(jié)合在酶分子的低親和位點(diǎn)，并且與底物的結(jié)合有關(guān)[16-17]，可能對(duì)酶學(xué)性質(zhì)的影響比較大。Goward等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)來源于大腸桿菌的蘋果酸脫氫酶“Loop”結(jié)構(gòu)處于酶分子的活性中心附近，把“Loop”結(jié)構(gòu)上的精氨酸突變?yōu)楣劝彼崽岣吡嗣傅臒岱€(wěn)定性。第363位上的氨基酸分別為甘氨酸和谷氨酸，由于氨基酸性質(zhì)的不同可能也造成了酶學(xué)性質(zhì)的不同。通過NCBI檢索與已報(bào)道的植酸酶核苷酸和氨基酸序列比對(duì)分析，phy(ycD)和 phy(ycE)與來源于枯草芽孢桿菌的phyC[19]，解淀粉芽孢桿菌FZB45的 phy[5]，核苷酸序列一致性為68%。在氨基酸序列上，與phyC和phy的一致性約為71%，而與Huang Huoqing等[20]從冰河土分離的Pedobacter nyackensis MJ11 CGMCC 2503菌株產(chǎn)生的中性植酸酶氨基酸一致性僅僅約為21%。對(duì)中性植酸酶酶學(xué)性質(zhì)研究也有很多報(bào)道，如Rao等[6]對(duì)來源于芽孢桿菌的植酸酶在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)的酶大多以包含體的形式存在，在含有一定濃度的脯氨酸的情況下，通過變復(fù)性實(shí)驗(yàn)，獲得有活性的酶分子，進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在pH5.0～8.0，溫度25～70℃都有活性，Ca2+對(duì)酶的再折疊和活性是必需的。Gulati等[13]從豆科植物根部土壤篩選出可以生產(chǎn)中性植酸酶的1株乳酸芽孢桿菌，并且對(duì)植酸酶進(jìn)行純化，酶學(xué)性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)最適溫度為70℃，最適pH值范圍在7～8之間，Ca2+可以提高它的熱穩(wěn)定性。姚斌等[21]利用大腸桿菌表達(dá)來源于枯草芽孢桿菌的中性植酸酶，經(jīng)過純化對(duì)其性質(zhì)研究，在37℃最適pH值為7.5，55℃條件下pH值為7.0；最適溫度55℃。本研究通過植酸鈣固體篩選培養(yǎng)基PSM從毛豆根部篩選出2株產(chǎn)中性植酸酶芽孢桿菌，進(jìn)一步通過LPM液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，由于表達(dá)宿主就是原始芽孢桿菌，酶的表達(dá)量低，通過SDS-PAGE未能檢測(cè)出來，但能夠測(cè)到酶的活性。對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)37℃條件下，Phy(ycD)和Phy(ycE)最適pH值為7.0。屬于中性植酸酶。最適溫度約為60℃，并且Ca2+對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)有影響。從酶學(xué)性質(zhì)比較可以確定，本實(shí)驗(yàn)分離的這2種菌株所產(chǎn)的植酸酶屬于β-螺旋槳植酸酶家族。目前，已將這兩個(gè)植酸酶分別在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，通過SDS-PAGE檢測(cè)到與預(yù)期分子質(zhì)量大小一致的蛋白表達(dá)條帶。下一步實(shí)驗(yàn)計(jì)劃是對(duì)在大腸桿菌中表達(dá)的重組Phy(ycD)、Phy(ycE)植酸酶進(jìn)行純化，對(duì)酶進(jìn)行定量，然后對(duì)這兩種酶的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)研究，探討結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。同時(shí)嘗試在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)該植酸酶，通過基因改造提高表達(dá)產(chǎn)量和酶的活性，為中性植酸酶的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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