孫長波，石磊嶺，涂建飛，韓丹丹，張清清，張 晶,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)展學(xué)院，吉林 長春 130600；3.新疆中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002)

桑葉為桑科(Moraceae)植物桑(Morus alba L.)的干燥葉子，藥用歷史悠久，具有廣泛的藥理活性，是中醫(yī)清熱解毒之要藥，用于風(fēng)熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭疼、目赤暈花等癥[1]。桑葉中多糖、黃酮及生物堿均可不同程度的降低糖尿病小鼠的血糖，促進(jìn)其肝糖元的合成，增加肝糖元含量[2-6]，增加糖尿病動物糖的貯藏能力，同時對其并發(fā)的血脂異常有一定的改善作用[7]。1-脫氧野尻霉素(DNJ)是桑葉中所特有的，且含量極高的生物堿類成分，黃酮類成分——蘆丁的含量在桑葉中也很高，它們均為天然的α-糖苷酶抑制劑[8-11]，可作為治療糖尿病、病毒感染、腫瘤轉(zhuǎn)移及溶酶體儲存紊亂等眾多疾病的藥物。自桑葉中提取降糖有效成分是現(xiàn)在的一個研究熱點(diǎn)。

真空氣流植物細(xì)胞破壁(vacuum air current for plant cell wall breakdown，VAPB)技術(shù)現(xiàn)主要應(yīng)用于將果蔬干燥，并制成非油炸脆片。其原理是：將新鮮植物樣品在密閉加壓條件下進(jìn)行加熱，使細(xì)胞內(nèi)水份急速汽化而使胞內(nèi)壓力迅速升高，然后對其進(jìn)行瞬間減壓，細(xì)胞壁因壓力巨變而破碎，得到細(xì)胞破壁植物樣品。保持破壁溫度至樣品干燥完全。此技術(shù)對植物細(xì)胞破壁率高，可達(dá)90%以上，且不改變藥材的外觀，溫度可根據(jù)植物樣品所含成分的性質(zhì)進(jìn)行控制。由于細(xì)胞壁的破碎，使內(nèi)部的有效成分更易被溶劑溶出，可大大提高有效成分的提取量。但此項(xiàng)技術(shù)在中藥成分提取的前處理過程中的應(yīng)用報道較少[12-13]。本實(shí)驗(yàn)就此技術(shù)對桑葉中有效成分提取率的影響進(jìn)行研究，將桑葉中多糖、生物堿、黃酮3類成分最大量的提取，可提高桑葉的藥效，利于其應(yīng)用開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

桑葉：真空氣流細(xì)胞破壁與未破壁桑葉樣品均由吉林省品品源生物科技有限公司提供，均為桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥葉，采集于2011年5月山東。桑葉經(jīng)真空氣流細(xì)胞破壁處理，電鏡檢測破壁率大于90%，即為破壁桑葉。分別粉碎，過60目篩，待用。

1.2 試劑與儀器

LC-2010高效液相色譜儀(SPD-10Avp紫外檢測器；LC-Solution色譜工作站)、UV-1700分光光度計(jì) 日本島津公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號0080-9750，純度≥98%) 中國食品藥品檢定研究院；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號20110514，純度≥98%) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；DNJ標(biāo)準(zhǔn)品(批號WKQ0117，純度≥98%) 四川維克奇生物科技有限公司；芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl，純度≥98%) 上海共價化學(xué)有限公司；甘氨酸(純度≥99%) 上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈(均為色譜純) 美國Fisher公司；純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)；其余試劑及藥品均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 HPLC法測定桑葉中DNJ含量

1.3.1.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2(4.6mm×250mm，5μm)；流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫：0～30min為30%～60%A；檢測波長：254nm；柱溫：25℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μL。

1.3.1.2 DNJ對照品溶液制備精密取DNJ標(biāo)準(zhǔn)品2.0mg，以甲醇定容至20mL，得0.1mg/mL的DNJ標(biāo)準(zhǔn)原溶液，從中分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL溶液，甲醇定容至1mL，得質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液，過膜，備用。

1.3.1.3 樣品溶液制備

取破壁和未破壁的桑葉各5.000g，分別用80%的乙醇溶液超聲提取3次，30min/次，合并提取液，濃縮至干，用甲醇分別定容到10mL，得破壁和未破壁的桑葉樣品原液。

1.3.1.4 柱前衍生化法測定DNJ的含量

分別取DNJ系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液、破壁及未破壁樣品原液各10μL于1mL容量瓶中，各加10μL硼酸鹽緩沖液(pH8.5)及10mmol/L Fmoc-Cl乙腈溶液20μL，混勻后于20℃水浴反應(yīng)20min，再加入10μL 0.2mol/L的甘氨酸，使過量衍生化試劑反應(yīng)，以水定容至1mL，混勻后過0.45μm的微孔濾膜，得質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/mL的DNJ的標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣品溶液。按1.3.1.1節(jié)進(jìn)行DNJ峰面積值的測定，由線性方程求出樣品液中DNJ的質(zhì)量濃度。

1.3.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和方法學(xué)考察

精密吸取衍生化的對照品溶液各20μL，進(jìn)樣，測定峰面積，以DNJ質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，DNJ的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，線性回歸，得到回歸方程：Y=3447430000X＋ 120459.6，R2=0.9992。線性范圍為0.2～1.0μg/mL。取0.2μg/mL的衍生化對照品溶液，稀釋成一系列的溶液，進(jìn)行分析，確定DNJ檢出限為0.02μg/mL(RSN= 3)。

精密度實(shí)驗(yàn)：取1.0μg/mL的DNJ對照品衍生溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密稱取未破壁桑葉粉，按1.3.1.3、1.3.1.4節(jié)制成衍生化供試品溶液，于制備后0、1、2、4、6、8h進(jìn)行測定。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：精密稱取2.500g未破壁桑葉粉6份，按1.3.1.3、1.3.1.4節(jié)分別制成供試品溶液，測定樣品中DNJ含量。

加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱取6份已知DNJ含量的未破壁桑葉粉各1.000g，分別加入0.1mg/mL的DNJ溶液2mL，按1.3.1.3和1.3.1.4節(jié)分別制成供試品溶液，測定其中DNJ含量。

1.3.2 HPLC法測定桑葉中蘆丁含量

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil ODS2(4.6mm×250mm，5μm)；流動相為甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫：0～10min為40%～50%A，10～15min時50%～55%A；檢測波長：358nm；柱溫：25℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μL。

1.3.2.2 蘆丁對照品溶液制備

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，以甲醇定容至50mL，搖勻，配制成0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。從中分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，以甲醇定容至1mL，配成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的蘆丁對照品溶液，過膜，備用。

1.3.2.3 樣品溶液的制備

取1.3.1.3節(jié)制備的破壁與未破壁樣品原液各2mL，以甲醇定容至10mL的容量瓶中，供測定蘆丁含量用。

1.3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和方法學(xué)考察

精密吸取蘆丁的對照品溶液各20μL，進(jìn)樣，測定峰面積，以蘆丁質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，線性回歸，得到回歸方程：Y=27184495X＋ 20465.1，R2=0.9999。線性范圍為0.0～0.1mg/mL。取0.02mg/mL的對照品溶液，稀釋成系列溶液，進(jìn)行分析，得蘆丁檢出限為0.002mg/mL(RSN= 3)。

精密度實(shí)驗(yàn)：取0.02mg/mL的蘆丁對照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密稱取1.000g破壁桑葉粉6份，按1.3.1.3節(jié)制成供試品溶液分別于0、1、2、4、6、8h進(jìn)行測定。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：精密稱取1.000g未破壁桑葉粉6份，分別制成供試品溶液，測定樣品中蘆丁含量。

加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱取6份已知蘆丁含量的未破壁桑葉粉各1.000g，分別加入1mg/mL的蘆丁溶液1mL制成供試品溶液，測定其中蘆丁含量。

1.3.2.5 樣品中蘆丁含量的測定

將1.3.1.3節(jié)制備的破壁及未破壁桑葉溶液20μL按照1.3.2.1節(jié)條件測定蘆丁峰面積，由線性方程求出樣品液中蘆丁的含量。

1.3.3 分光光度法測定桑葉中多糖含量

1.3.3.1 葡萄糖對照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖對照品25.0mg于25mL的容量瓶，加水溶解至刻度，得1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mL于10mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.16、0.32mg/mL的葡萄糖系列對照品溶液。過膜，備用。

1.3.3.2 硫酸-蒽酮法測定桑葉中多糖含量[14]

精密吸取葡萄糖系列對照溶液及蒸餾水各1.0mL，分別置于10mL具塞試管中，冰水浴5min，加入0.2%蒽酮硫酸試液4mL搖勻，立即置于沸水浴加熱15min，取出，冷水冷卻至室溫，室溫放置10min左右，于620nm波長處測定吸收度。以葡萄糖質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程：A=1.151ρ＋0.3714，R2=0.9994。線性范圍為0.02～0.32mg/mL。

1.3.3.3 樣品溶液的制備

取破壁和未破壁的桑葉各5.000g，分別置于索氏提取裝置中，用石油醚(60～90℃)回流2h，再用95%乙醇回流2h，進(jìn)行脫脂處理。殘?jiān)鼡]干溶劑，加水50mL，40℃超聲提取3次，30min/次，合并提取液，用Sevag法(氯仿-正丁醇體積比4:1)去除蛋白，6000r/min離心20min，取上清液濃縮至5mL，加無水乙醇使乙醇含量達(dá)80%以上，靜置12h，抽濾，得沉淀物，用乙醇和丙酮各洗脫3次，于60℃干燥得白色無定形粉末。將其以水定容于100mL容量瓶中，供多糖含量測定。

1.3.3.4 樣品中多糖含量的測定

取1.3.1.3節(jié)制備的破壁及未破壁溶液各1mL，按照1.3.3.2節(jié)方法進(jìn)行樣品溶液的吸光度的測定，通過回歸方程計(jì)算出多糖的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNJ的HPLC測定結(jié)果

參照文獻(xiàn)[15-17]方法，對DNJ進(jìn)行柱前衍生化，有效的去除了雜質(zhì)，并在HPLC測定條件上進(jìn)行了改善，采用乙腈-水梯度洗脫，DNJ衍生化產(chǎn)物的保留時間在18.7min左右，其他衍生化試劑吸收峰的保留時間大于29min，所得峰形對稱，分離度高，干擾小，且避免了酸對色譜柱的損傷。色譜圖見圖1。

圖 1 DNJ含量測定的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of DNJ

DNJ精密度實(shí)驗(yàn)，其保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.37%(n = 6)，峰面積的RSD為1.32%(n = 6)，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，DNJ峰面積的RSD為0.52%(n = 6)，說明樣品液在8h內(nèi)基本穩(wěn)定；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的RSD為1.98% (n = 6)，說明方法可行；加樣回收率實(shí)驗(yàn)，加樣回收率為98.76%，RSD為2.11%(n = 6)。經(jīng)方法學(xué)考察，結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

2.2 蘆丁的HPLC測定結(jié)果

蘆丁為酸性成分，采用HPLC法測定其含量時，流動相中常加入酸，以防止拖尾現(xiàn)象的產(chǎn)生[18-20]。本實(shí)驗(yàn)所建立的測定條件中，避免了酸的使用，且由圖2可知，經(jīng)方法學(xué)考察及樣品中蘆丁含量檢測的應(yīng)用，色譜峰分離度高，峰面積值穩(wěn)定。

精密度實(shí)驗(yàn)，保留時間的RSD值為0.87%，峰面積的RSD 為1.59%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，蘆丁峰面積RSD值為1.12%(n = 6)，說明樣品液在8h內(nèi)基本穩(wěn)定；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，RSD為1.41%(n = 6)，說明方法可行；加樣回收率實(shí)驗(yàn)，加樣回收率為99.07%，RSD為1.45%(n = 6)。

2.3 破壁與未破壁桑葉比較結(jié)果

由表1可知，經(jīng)真空氣流植物細(xì)胞破壁技術(shù)(VAPB)處理的桑葉，其DNJ、蘆丁及多糖含量測定值均明顯高于未進(jìn)行破壁處理樣品。破壁處理對多糖的測定值影響最小，為未破壁處理樣品值的1.48倍；對DNJ及黃酮的影響則分別為1.74倍和1.58倍。

表 1 破壁與未破壁桑葉中DNJ、蘆丁及多糖的測定含量(n=3)Table 1 Contents of DNJ, rutin and polysaccharose in mulberry leaf samples (n=3)mg/g

3 結(jié) 論

通過比較VAPB處理前后的桑葉樣品中DNJ、蘆丁及多糖含量的測定值可知，VAPB在桑葉有效成分提取過程中發(fā)揮了極大的作用，破壁較未破壁桑葉樣品中的生物堿、黃酮及多糖含量的測定值分別高出74%、58%和48%，使有效成分溶出量顯著提高，可使其藥理活性得到更充分的發(fā)揮。將VAPB技術(shù)應(yīng)用于其他植物中成分的提取具有極大的推廣潛力。

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