羅照明，董 捷，趙亮亮，張紅城*

(中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，國家農(nóng)產(chǎn)品加工中心蜂產(chǎn)品加工分中心，北京 100093)

蜂膠是工蜂采集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠黏性物質(zhì)。蜂膠在世界各地的民間醫(yī)藥利用方面具有悠久的歷史，而且日益成為廣泛接受的保健品。具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血壓、降血糖、提高免疫力等多種生理功能活性，這些功能與蜂膠的成分密切相關[1-2]。一般來說，蜂膠含有多酚類(包括黃酮、酚酸其酯類)、萜烯類、醇酮類、脂肪酸、氨基酸等功能成分，其中多酚類是蜂膠醇提物中最主要的功能成分[3-4]。研究表明我國蜂膠中含有大量的多酚類物質(zhì)，報道較多的酚酸及其酯類物質(zhì)有咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、亞桂皮乙酸、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸肉桂酯，黃酮有5-甲氧基短葉松素、短葉松素、山奈酚、芹菜素、松屬素、短葉松素-3-乙酸酯、柯因、高良姜素、柚木柯因[5-9]，不同活性成分的功能是不同的，例如咖啡酸、咖啡酸肉桂酯、槲皮素、山奈酚具有很強的抗氧化活性[10]，咖啡酸苯乙酯具有很強的抗癌作用，對腫瘤細胞具有特定的殺傷力[11]，這些成分在蜂膠中含量的高低也決定了蜂膠的生理功能。大部分研究者只對于蜂膠中的10多種多酚類物質(zhì)進行了定量分析[5,10]。蜂膠中多酚類成分的研究，一方面有利于蜂膠質(zhì)量的控制，另一方面為蜂膠的功能活性的研究提供理論依據(jù)。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)具有分離效率高、分析速度快、應用范圍廣及靈敏度高等特點，已成為蜂膠成分分析中最重要的方法之一[12]。本研究利用高效液相色譜法對收集到9個河南蜂膠樣品的75%乙醇提取物中多酚類物質(zhì)進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河南省拓城、新野、南陽、安陽、方城、淮濱、商丘7個地區(qū)的蜂膠毛膠分別由當?shù)胤滢r(nóng)采集了9個樣品，由中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所提供，粉碎后冷凍保存；3,4-二羥基苯甲醛、咖啡酸、香蘭素、p-香豆酸、阿魏酸、異阿魏酸、苯甲酸、蘆丁、3,4-二甲氧基肉桂酸、楊梅酮、肉桂酸、桑色素、短葉松素、槲皮素、山姜素、山奈酚、亞桂皮乙酸、芹菜素、異鼠李素、松屬素、柯因、咖啡酸苯乙酯、高良姜素、山奈素、球松素、柚木柯因、肉桂酸肉桂酯、香草酸、4-甲氧基肉桂酸、水楊苷、水楊醇、水楊酸(以上均為色譜純) 美國Sigma公司；甲醇(CR) 美國Fisher公司；短葉松素-3-乙酸酯 收集自制。

1.2 儀器與設備

WK-600A高速粉碎機 青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司；Milli-Q Intergral純水/超純水一體化系統(tǒng) 美國Merk Millipore公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5型低速離心機 上海安亭科學儀器廠；微量移液器 德國Eppendorf公司；HZS-H型水浴搖床 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；LC-6AD高效液相色譜儀(配有二極管陣列紫外檢測器(PDA)、SIL-自動進樣器、CTO-10A柱溫箱、LCsolution數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)) 日本島津公司；1100高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源) 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂膠樣品的處理

參考相關蜂膠樣品前處理文獻[13]，將蜂膠樣品放入冰箱冷凍2h，然后粉碎，準確秤取1g于50mL的具塞錐形瓶中，加入20mL 75%乙醇溶液，置于超聲波清洗器中超聲3h。然后在40℃、100r/min水浴搖床中提取12h，提取結束后，離心收集蜂膠提取液，于25mL容量瓶定容，然后稀釋6倍，經(jīng)0.22μm微孔膜過濾，待用。

1.3.2 HPLC色譜和質(zhì)譜分析條件

H P L C 條件： S h i m - P a c k P R E P -ODS(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；柱溫箱溫度35℃；檢測波長280nm；進樣量10μL；流動相：B相為甲醇(含0.1%乙酸)，A相為水(含0.1%乙酸)，梯度洗脫程序如下：0～25min，22%～36% B；25～55min，36%～52% B；55～90min，52%～63% B；90～115min，63%～70% B；115～135min，70%～75% B；135～150min，75%～80% B；流速：1mL/min。

質(zhì)譜分析條件：電噴霧離子化電離源，正離子模式檢測，離子源噴射電壓為3.5kV；毛細管加熱溫度350℃，毛細管電壓30V；霧化氣(N2)流速為80kPa；干燥氣(N2)流速為9L/min；碰撞氣體為氦氣；全離子掃描方式，掃描范圍m/z 50～2000。

2 結果與分析

2.1 HPLC色譜條件的選擇

本實驗分別采用乙腈-水、甲醇-水為流動相，但由于蜂膠醇提物成分多樣，乙腈在反相色譜柱中洗脫能力強，各峰保留時間較靠前，不容易分離開，所以采用甲醇-水為流動相。蜂膠所含的一些酚類物質(zhì)容易解離，加入0.1%乙酸可以有效地抑制色譜峰的拖尾。蜂膠成分復雜，采用梯度洗脫，根據(jù)色譜峰的保留時間，一步步調(diào)整梯度濃度，直到各色譜峰獲得較好的分離效果。多酚類物質(zhì)的紫外最大吸收峰集中在230～370nm之間，實驗表明選定280nm測定，各峰容易檢測出來而且基線平穩(wěn)，同時參考蜂膠相關文獻[14-15]，所以選擇280nm測定。

2.2 河南蜂膠的醇提物中多酚類成分的定性分析

圖 1 標準品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard solution

圖 2 河南蜂膠的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of propolis from Henan province

根據(jù)國內(nèi)外對于我國蜂膠醇提物多酚類成分的報道[5-9,16]，搜集了33種標準品，通過HPLC色譜圖分析，各成分得到了較好的分離，峰形對稱，基線平穩(wěn)，如圖1所示。圖2為9種河南蜂膠醇提物的HPLC色譜圖，通過蜂膠醇提物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，以及與標準品的保留時間、紫外光譜比較，另外還通過加入標準品內(nèi)標法對蜂膠成分進行定性檢測。從圖2可以看出，通過本方法可以從蜂膠醇提物中分離出40多個成分，前46min都是酚酸類成分，按出峰順序，依次有3,4-二羥基苯甲醛、咖啡酸、香蘭素、p-香豆酸、阿魏酸、異阿魏酸、苯甲酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸，此外亞桂皮乙酸出峰時間為63min；46min之后除了亞桂皮乙酸都是黃酮和酯類物質(zhì)，按出峰順序依次有5-甲氧基短葉松素、短葉松素、槲皮素、山姜素、山奈酚、芹菜素、異鼠李素、松屬素、咖啡酸芐酯、短葉松素-3-乙酸酯、柯因、咖啡酸苯乙酯、高良姜素、p-香豆酸芐酯、咖啡酸肉桂酯、球松素、柚木柯因、肉桂酸肉桂酯。

部分文獻[17-18]提到在我國蜂膠中含有較多的蘆丁、桑色素、楊梅酮、槲皮素，而在本實驗檢測的蜂膠樣品中不含有蘆丁和楊梅酮這些成分，并且槲皮素、桑色素含量很少。其中原因可能是一些研究者的HPLC分離方法的時間短(一般小于70min)，由于蜂膠醇提物中成分非常多，許多成分的極性相近，造成HPLC的保留時間是非常接近的，許多成分沒有完全分離開，因此僅以保留時間對這些成分進行確認是不充分的。而且許多成分的紫外光譜也非常相似。因此如果分離條件不合適，這些成分就不易區(qū)分，如蘆丁和3,4-二甲氧基肉桂酸、短葉松素和槲皮素等。這是導致我國蜂膠成分檢測時出現(xiàn)異議的一個重要原因。

現(xiàn)行的蜂膠國家標準GB/T19427—2003《蜂膠中蘆丁、楊梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松屬素、苛因、高良姜素含量的測定方法》要求檢測蜂膠中的8種黃酮：蘆丁、楊梅酮、槲皮素、松屬素、柯因、高良姜素、山奈酚(莰菲醇)、芹菜素。本實驗分析發(fā)現(xiàn)河南蜂膠中不含有蘆丁、楊梅酮，而槲皮素、山奈酚、芹菜素含量都很低，而且蜂膠中的活性成分不僅包括黃酮類物質(zhì)，還有酚酸及其酯類成分，如咖啡酸、咖啡酸苯乙酯等。趙亮亮等[19]在分析北方地區(qū)11個蜂膠樣品時，也發(fā)現(xiàn)了同樣的結果。因此以此8種黃酮類化合物的檢測作為蜂膠的國家標準，有待進一步的商榷。建議在修訂國家標準時，除了維持檢測蜂膠中松屬素、柯因、高良姜素含量外，增加對于咖啡酸苯乙酯、咖啡酸、p-香豆酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、短葉松素、短葉松素-3-乙酸酯的檢測，它們在我們國家蜂膠里普遍存在，而且含量比較高。

另外，2012年8月實施的行業(yè)標準GH/T 1081—2012《蜂膠中楊樹膠的檢測方法：反相高效液相色譜法》，通過213nm紫外檢測蜂膠樣品中是否存在水楊苷和CCP，判斷蜂膠中是否含有楊樹膠。該方法認為楊樹膠中含有水楊苷，蜜蜂在采集楊樹膠的過程中會混入其下顎腺分泌的β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶能夠水解楊樹膠中的水楊苷[20]，水楊苷會水解變成水楊醇。因此如果楊樹膠中含有水楊苷，那么蜂膠中就應該含有水楊醇。通過檢測蜂膠中水楊苷、水楊醇和水楊酸，發(fā)現(xiàn)河南蜂膠樣品中既不含有水楊苷，也不含有水楊醇，以及水楊酸(圖1、2)。因此用水楊苷來檢測蜂膠中是否含有楊樹膠，仍需要進一步的探討。

圖 3 5-甲氧基短葉松素(A)、咖啡酸芐酯(B)、p-香豆酸芐酯(C)和咖啡酸肉桂酯(D)的質(zhì)譜圖和紫外光譜圖(角圖)Fig.3 ESI-MS mass spectra and UV absorption spectra of 5-methoxy pinobanksin (A), benzyl caffeate (B), p-coumaric acid benzyl ester (C) and caffeic acid cinnamyl ester (D)

Ahn等[21]通過HPLC-DAD和質(zhì)譜從河南蜂膠中也鑒定出咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、異阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、亞桂皮乙酸、松屬素、柯因、咖啡酸苯乙酯、高良姜素、柚木柯因。Yang Haisha等[6]對來源于安徽的蜂膠樣品進行了研究，通過色譜數(shù)據(jù)(HPLC、HPTLC)、光譜數(shù)據(jù)(UV、IR)，并結合質(zhì)譜和核磁共振技術，及標準品和相關文獻，確認22個化合物：p-香豆酸、異阿魏酸、3,4二甲氧基肉桂酸、5-甲氧基短葉松素、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、短葉松素、鼠李檸檬素、咖啡酸-3-甲基-丁烯酯、咖啡酸-3,3-二甲基-丙烯酯、咖啡酸-2-甲基-2-烯酯、柯因、短葉松素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸肉桂酯、咖啡酸芐酯、3,3’-二甲氧基槲皮素、柚木柯因、3-乙基-7-甲氧基-短葉松素、7-甲氧基高良姜素。由于有些成分沒有標準品，結合文獻[22-23]及出峰的保留時間、紫外光譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，本實驗在河南蜂膠醇提物樣品中還鑒定出5-甲氧基短葉松素(圖3A)、咖啡酸芐酯(圖3B)、p-香豆酸芐酯(圖3C)、咖啡酸肉桂酯(圖3D)成分，這些成分在河南蜂膠樣品中也普遍存在。

2.3 河南蜂膠的醇提物中多酚類成分的含量

表 1 9種河南蜂膠醇提物中多酚類成分的含量Table 1 Contents of polyphenols in 75% ethanol extracts of nine propolis samples from Henan province

河南地區(qū)9個蜂膠樣品醇提物各組分的含量如表1所示。可以看出，蜂膠中含有的酚酸及酯類主要有咖啡酸苯乙酯、亞桂皮乙酸、p-香豆酸、苯甲酸、異阿魏酸、咖啡酸、3,4-二甲氧基肉桂酸，這7種酚酸及酯類物質(zhì)占已定量的總酚酸及酯類成分的85%，其中咖啡酸苯乙酯含量最多，平均1g蜂膠含有該成分8.89mg，南陽1蜂膠樣品含該成分最高達1.5%?？Х人岜揭阴δ[瘤細胞具有特定的殺傷力，對惡性的病變組織有細胞毒性作用，表現(xiàn)出極強的抑制癌細胞作用[1-2]；黃酮類成分主要有短葉松素-3-乙酸酯、柯因、松屬素、短葉松素及高良姜素，這5種黃酮占已定量總黃酮的92%，其中短葉松素-3-乙酸酯、柯因、松屬素含量較高，其平均含量都超過蜂膠重量的2%，短葉松素-3-乙酸酯的平均含量最高為3.5%，方城的蜂膠樣品含該成分最高達5.2%。Gardana等[24]檢測來自于亞洲地區(qū)的蜂膠樣品，其中含量較高的黃酮有柯因(2%～4%)，松屬素(2%～4%)，短葉松素-3-乙酸酯(1.6%～3%)及高良姜素(1%～2%)，與本研究結果接近。

從表1可以看出，9種河南蜂膠醇提物的總酚酸及酚酸酯類含量范圍為1.4%～4.7%，平均含量3.2%，其中新野1蜂膠樣品含有的酚酸及酯類物質(zhì)最高達4.7%。總黃酮含量的范圍為5.6%～19.4%，平均含量13%，其中方城蜂膠樣品含有黃酮類物質(zhì)最高達19.4%。9個的蜂膠樣品都含有的酚酸類成分，有咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、異阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、亞桂皮乙酸；都含有的黃酮類成分有短葉松素、山姜素、松屬素、短葉松素-3-乙酸酯、柯因、高良姜素、柚木柯因。這表明這些成分在我國蜂膠普遍存在，其中亞桂皮乙酸、短葉松素-3-乙酸酯、短葉松素、山姜素這些成分，在國內(nèi)的文獻報道比較少。從圖2和表1可以看出，在9個蜂膠樣品中，拓城的蜂膠樣品與其他的蜂膠樣品相比，其p-香豆酸含量和p-香豆酸芐酯含量很高，p-香豆酸含量達1.2%，而p-香豆酸在9個蜂膠樣品中的平均含量只有0.3%。該樣品的黃酮類含量較低，只有5.6%。可以看出，拓城的蜂膠樣品與其他的蜂膠樣品相比有很大的不同，其余的蜂膠樣品在成分組成上具有很大的相似性。不同的蜂膠樣品各組分含量不同，主要是受膠源植物、季節(jié)、地域的影響[25-26]。蜂膠的功能活性與蜂膠的成分密切相關，不同來源的蜂膠，因其成分不同，其功能活性也有一定的差異。因此，對我國蜂膠成分進行系統(tǒng)研究，為開發(fā)蜂膠保健食品和藥理學研究提供了理論基礎[27-28]。

3 結 論

本研究采用HPLC方法分析9個河南蜂膠醇提物中29種多酚類化合物。發(fā)現(xiàn)蜂膠中含有的酚酸及酯類主要有咖啡酸苯乙酯、亞桂皮乙酸、p-香豆酸、苯甲酸、異阿魏酸、咖啡酸、3,4-二甲氧基肉桂酸，這7種酚酸及酯類物質(zhì)占已定量的總酚酸及酯類成分的85%，其中咖啡酸苯乙酯含量最多，平均1g毛膠中含有該成分8.89mg；黃酮類成分主要有短葉松素-3-乙酸酯、柯因、松屬素、短葉松素及高良姜素，這5種黃酮占已定量總黃酮的92%，其中短葉松素-3-乙酸酯的平均含量最高，為3.5%。

[1] 董捷, 張紅城, 尹策, 等. 蜂膠研究的最新進展[J]. 食品科學, 2007, 28(9)： 639-642.

[2] BANKOVA V. Recent trends and important developments in propolis research[J]. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 2005, 2(1)： 29-32.

[3] MEDANA C, CARBONE F, AIGOTTI R, et al. Selective analysis of phenolic compounds in propolis by HPLC-MS/MS[J]. Phytochemical Analysis, 2008, 19(1)： 32-39.

[4] KUMAZAWA S, HAYASHI K, KAJIYA K, et al. Studies of the constituents of Uruguayan propolis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(17)： 4777-4782.

[5] SHI Haiming, YANG Haisha, ZHANG Xiaowei, et al. Identification and quantification of phytochemical composition and antiinflammatory and radical scavenging properties of methanolic extracts of Chinese propolis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(50)： 12403-12410.

[6] YANG Haisha, DONG Yuqiong, DU Huijing, et al. Antioxidant compounds from propolis collected in Anhui China[J]. Molecules, 2011, 16： 3444-3455.

[7] 符軍放. 中國蜂膠中酚類化合物的色譜分析方法研究[D]. 西安： 西北大學, 2006.

[8] 楊理, 閆清華, 鄧月娥, 等. 高效液相色譜法檢測蜂膠中黃酮類物質(zhì)的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(6)： 353-355.

[9] 羅照明, 張紅城. 中國蜂膠化學成分及其生物活性的研究[J]. 中國蜂業(yè), 2012, 63(2)： 55-62.

[10] SHIGENORI K, TOMOKO H, TSUTOMU N. Antioxidant activity of propolis of various geographic origins[J]. Food Chemistry, 2004, 84(3)： 329-339.

[11] 玄紅專, 胡福良, 顧美兒, 等. 蜂膠中咖啡酸苯乙酯的研究進展[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 27(5)： 14-15.

[12] MIDORIKAWA K, BANSKOTA A H, TEZUKA Y, et al. Liquid chromatography-mass spectrometry analysis of propolis[J]. Phytochemical Analysis, 2001, 12(6)： 366-373.

[13] 吳正雙. 蜂膠提取物中酚類化合物分析及其抗氧化和抗腫瘤活性研究[D]. 廣州： 華南理工大學, 2011.

[14] KUMAZAWA S, HAYASHI K, KAJIYA K, et al. Studies of the constituents of Uruguayan propolis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(17)： 4777-4782.

[15] FEDERICA P, GIULIA O, DIEGO P, et al. HPLC-DAD and HPLCESI-MS/MS methods for metabolite profiling of propolis extracts[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2011, 55： 934-948.

[16] MACIEJEWICZ W, DANIEWSKI M，DZIDO T H, et al. GC-MS and HPLC analysis of phenolic acids extracted from propolis and from Populus nigra bud exudates[J]. Chemistry Analysis (Warsaw), 2002, 47(1)： 21-30.

[17] 徐元君, 羅麗萍, 麗艷, 等. HPLC測定兩種中國蜂膠醇提物化學組成[J]. 林產(chǎn)業(yè)化學與工業(yè), 2010, 30(2)： 61-66.

[18] 李熠, 趙靜, 薛曉鋒 等. 超高效液相色譜法同時測定蜂膠中的12種活性成分[J]. 色譜, 2007, 25(6)： 857-860.

[19] 趙亮亮, 王光新, 陳平, 等. 高效液相色譜法分析北方部分地區(qū)蜂膠醇提物成分[J]. 食品科學, 2012, 30(18)： 143-148.

[20] ZHANG Cuiping, ZHENG Huoqing, LIU Gang, et al. Development and validation of HPLC method for determination of salicin in poplar buds： application for screening of counterfeit propolis[J]. Food Chemistry, 2011, 127： 345-350.

[21] AHN M R, SHIGENORI K, YUMIKO U, et al. Antioxidant activity and constituents of propolis collected in various areas of China[J]. Food Chemistry, 2007, 101： 1383-1392.

[22] USIA T, ARJUN H, BANSKOTA O, et al. Constituents of chinese propolis and their antiproliferative activities[J]. Journal of Natural Products, 2002, 65： 673-676.

[23] SHA Na, GUAN Shuhong, LU Zhiqiang, et al. Cytotoxic constituents of chinese propolis[J]. Journal of Natural Products, 2009, 72： 799-801.

[24] GARDANA C, SCAGLIANTI M, PIETTA P, et al. Analysis of the polyphenolic fraction of propolis from different sources by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2007, 45： 390-399.

[25] VALENCIA D, ALDAY E, RAMON R Z, et al. Seasonal effect on chemical composition and biological activities of Sonoran propolis[J]. Food Chemistry, 2012, 131： 645-651.

[26] SILICI S, UNLU M, VARDAR U G. Antibacterial activity and phytochemical evidence for the plant origin of Turkish propolis from different regions[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2007, 23(12)： 1797-1803.

[27] MENDES D, SILVA F J, SOUZA M C, et al. Correlation analysis between phenolic levels of Brazilian propolis extracts and their antimicrobial and antioxidant activities[J]. Food Chemistry, 2006, 99： 431-435.

[28] GREGORIS E, STEVANATO R. Correlations between polyphenolic composition and antioxidant activity of Venetian propolis[J]. Food and Chemical Toxicology, 2010, 48： 76-82.