，，

(1 青島大學醫(yī)學院藥學系,山東 青島 266021； 2 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科； 3 中國海洋大學分子藥理室)

胃癌是世界上常見的惡性腫瘤之一, 其發(fā)生率和死亡率在各類腫瘤中仍居首位。胃癌在癌變前多數(shù)經(jīng)歷了較長的演變，目前較公認的胃癌發(fā)病模式為正常胃黏膜→腸上皮化生→異型增生→胃癌[1]。在這里發(fā)生了上皮細胞間質(zhì)化(EMT)過程[2-5]。目前研究證實，胃癌與飲食因素中的亞硝基化合物, 尤其是亞硝胺類化合物有關[2]。本研究以N-甲基-N′-硝基N-亞硝基胍(MNNG)作用于永生化的人類胃黏膜上皮細胞GES-1[3]，系統(tǒng)地觀察細胞形態(tài)的變化，同時檢測細胞中神經(jīng)鈣黏附素(N-cadherin)與磷酸化信號傳導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(P-STAT3)表達的改變,為今后深入研究EMT靶向藥物提供細胞模型?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 細胞株

永生化的人胃黏膜上皮細胞系GES-1購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 試劑

MNNG系美國Sigama公司產(chǎn)品，1640培養(yǎng)液、胎牛血清系美國GIBCO公司產(chǎn)品，抗體N-cadherin、P-STAT3、HRP-羊抗鼠二抗、HRP-羊抗兔二抗均系美國Cell Signalin公司產(chǎn)品，β-actin抗體系美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，ECL發(fā)光試劑系美國Thermo公司產(chǎn)品，一抗、二抗去除液系碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀器與設備

超凈工作臺、臺式高速冷凍離心機、CO2培養(yǎng)箱系德國Heraeus公司產(chǎn)品，蛋白電泳系統(tǒng)系美國BIORAD公司產(chǎn)品，凝膠掃描成像系統(tǒng)系北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品，半干轉(zhuǎn)膜儀系大連竟邁生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 實驗方法

1.4.1GES-1細胞培養(yǎng) GES-1細胞在1640培養(yǎng)液(含體積分數(shù)0.10胎牛血清)中，于37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2條件下培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.4.2MNNG誘導GES-1細胞轉(zhuǎn)化 取對數(shù)生長期的GES-1細胞2.0×105個，種于60 mm培養(yǎng)皿中，每皿加入5 mL培養(yǎng)液，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2條件下培養(yǎng)過夜，加入2.0×10-5mol/L MNNG，避光培養(yǎng)24 h后，換新鮮1640培養(yǎng)液(含體積分數(shù)0.10胎牛血清)培養(yǎng)，1周左右可見大量細胞死亡脫落，殘存的細胞2周后長至70%～80%的飽和度時開始按GES-1細胞培養(yǎng)法消化傳代，傳至第4代時，凍存留用。

1.4.3GES-1、MC細胞中胃癌相關蛋白N-cadherin、P-STAT3表達的測定 分別取對數(shù)生長期的GES-1、MC細胞2.0×104個，種于6孔板中，每孔加3 mL培養(yǎng)液，于37 ℃，體積分數(shù)0.05 CO2條件下培養(yǎng)過夜；收集細胞，制備蛋白電泳樣品，用預冷的PBS洗3次，各孔加入90 μL細胞裂解液，冰浴裂解30～40 min；刮取細胞裂解液，沸水煮5 min使蛋白變性，-20 ℃保存。采用Western Blot方法檢測N-cadherin與P-STAT3蛋白表達。

2 結 果

2.1 細胞形態(tài)學改變

GES-1細胞形態(tài)隨著繼續(xù)傳代從初始建株時的上皮樣細胞逐漸變?yōu)樗笮危毎g排列稀疏，呈散在性生長。經(jīng)過MNNG處理后的細胞從初始的梭形，隨傳代的繼續(xù)形態(tài)逐漸變?yōu)椴灰?guī)則，細胞間接觸緊密，呈“島樣”克隆生長，克隆間界限清楚，以梭形細胞環(huán)繞。多數(shù)細胞具有單核，也出現(xiàn)多核巨大細胞，胞漿內(nèi)可見空泡，命名為MC細胞。見圖1、2。

2.2 GES-1、MC細胞中胃癌相關蛋白N-cadherin表達的檢測

實驗結果顯示，MNNG誘導過后胃癌相關蛋白N-cadherin的表達量增多。見圖3。

2.3 GES-1、MC細胞中胃癌相關炎癥蛋白P-STAT3表達的檢測

實驗結果顯示，MNNG誘導過后P-STAT3 的表達量增多。見圖4。

3 討 論

EMT是指上皮細胞在正常的生理和特定的病理情況下向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，是以上皮細胞喪失極性和黏附性并獲得間質(zhì)特性為主要特征的一個復雜過程。在此過程中，一個重要的分子事件就是鈣黏蛋白表達的異常[6]，N-cadherin屬于鈣黏蛋白家族,為目前已知的與腫瘤轉(zhuǎn)移有關的黏附分子之一，N-cadherin與細胞間的黏附、分化、侵襲和信號傳導有關。N-cadherin在上皮細胞中,可促使細胞形態(tài)向成纖維細胞發(fā)展,是細胞侵襲、浸潤的促進者[7]。N-cadherin只表達于成熟的神經(jīng)、肌肉和造血組織等神經(jīng)外胚層和中胚層來源的組織，正常上皮組織往往不表達，這種N-cadherin在上皮組織中的異位表達可影響上皮細胞的形態(tài)和行為，誘導其發(fā)生向間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，即發(fā)生EMT。本實驗結果顯示，MNNG可以誘導GES-1細胞發(fā)生成纖維細胞樣形態(tài)改變，并導致N-cadherin分子高表達，表明MNNG誘導的GES-1細胞發(fā)生了EMT轉(zhuǎn)化。

圖1GES-1細胞形態(tài)

圖2MC細胞形態(tài)

圖3 胃癌相關蛋白N-cadherin的表達

圖4 胃癌相關炎癥蛋白P-STAT3的表達

研究顯示，STAT3及其磷酸化形式P-STAT3在人類多種惡性腫瘤，如胃癌、頭頸部鱗狀細胞癌、乳癌、結直腸癌等組織中均存在異常高表達或活性增強[8]。有研究認為，P-STAT3表達與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移及預后相關[9]。P-STAT3蛋白可以作為胃癌診斷和預后判斷的分子標志物，有望為深入研究胃癌的診斷與治療提供新的思路。本實驗結果顯示，MNNG誘導的GES-1細胞高表達P-STAT3，進一步說明MNNG作用后GES-1細胞具有了胃癌細胞的性質(zhì)。

GES-1細胞是由人胎兒胃黏膜上皮細胞轉(zhuǎn)染SV-40病毒后獲得的永生化的細胞系，可以在體外穩(wěn)定傳代,但保留了正常的細胞骨架結構,在裸鼠體內(nèi)不致瘤,在軟瓊脂中也不形成集落,被認為在體外研究胃黏膜的癌變有較大價值[4]。

本研究使用與胃癌相關的亞硝胺類化合物MNNG對永生化的人胃黏膜上皮細胞系GES-1進行惡性轉(zhuǎn)化實驗,成功誘導得到了胃癌癌前病變的細胞，為深入研究治療EMT的靶向藥物提供了一種細胞模型。

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