張嬌 綜述 王秋菊 審校

聽神經病譜系障礙（auditory neuropathy spectrum disorder，ANSD），也稱為聽神經?。╝uditory neuropathy，AN），是一種外毛細胞功能正常，而內毛細胞和聽神經突觸和／或聽神經本身功能不良導致的聽功能障礙［1，2］。ANSD 典型的臨床表現(xiàn)［3～7］是言語理解力受損，而言語覺察閾和純音聽閾可以正常，也可以嚴重受損。ANSD 主要影響對快速變化聲信號的處理，即聽覺時間處理的能力［3］。

ANSD 的病因可為非遺傳因素和遺傳因素。非遺傳性因素［8～10］包括高膽紅素血癥、缺氧、營養(yǎng)代謝性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、中毒性代謝性疾病等。近年來，隨著分子遺傳學研究的不斷深入，遺傳因素在ANSD 發(fā)病中的作用日益受到重視。在引起聽神經病譜系障礙的眾多因素中，遺傳因素約占40%［11］，其遺傳方式涉及4種主要遺傳途徑，即常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X－染色體連鎖遺傳、線粒體遺傳。根據(jù)是否合并其他系統(tǒng)的疾病，ANSD 又可分為非綜合征型和綜合征型。很多ANSD 患者表現(xiàn)為非綜合征型遺傳，其中與常染色體顯性遺傳性相關的基因是DIAPH3（diaphanous homolog 3）基因［12，13］，與常染色體隱性遺傳相關的基因有 OTOF［14］、PJVK［15］和GJB2［16］，表現(xiàn)為X－染色體連鎖遺傳的基因座有AUNX1［17］，與線粒體遺傳相關的基因突變有12SrRNA T1095C突變［18］。其中，DIAPH3基因是第一個發(fā)現(xiàn)的與常染色體顯性遺傳性ANSD 相關的致病基因［11］，本文對該基因的結構、功能及其與ANSD 的關系等綜述如下。

1 DIAPH3基因的結構

DIAPH3基因又名AUNA1基因、DRF3基因，定位于13q21.2，DNA 序列全長498 403bp，含29個外顯子。由于剪接位點的不同，DIAPH3 基因有多種不同的轉錄變異體（表1），包括isoform a、isoform b、isoform c、isoform d、isoform e、isoform f、isoform g。有研究報道不同的轉錄本具有組織和時間特異性［19］，其中，isoform a 最長，常作為DIAPH3基因cDNA 的標準序列［20］，其mRNA 全長4 812bp，CDS 在mRNA 的220bp～3 801bp 區(qū)域，編碼含有1 193個氨基酸的蛋白質。

表1 DIAPH3基因的不同轉錄本及其編碼的蛋白質

DIAPH3基因編碼的蛋白質diaphanous homolog 3（DIAPH3蛋白），是一種多結構域的蛋白（圖1），包含一個氨基端的GTPase結合結構域（GTPase binding domain，GBD）長度為183個氨基酸殘基（115～297）；一個FH3結構域（formin homology 3，F(xiàn)H3），長度為193個氨基酸殘基（302～494）；一個FH2結構域（formin homology 2，F(xiàn)H2），長度為374個氨基酸殘基（636～1 009）；一個C 端diaphanous自調節(jié)結構域（diaphanous antoregulatory domain，DAD），長度為15 個氨基酸殘基（1 060～1 074）［20～22］。DIAPH3蛋白屬于diaphanous相關成蛋白家族（diaphanous－related formins），目前已發(fā)現(xiàn)了該家族的3 個亞型（DIAPH1、DIAPH2、DIAPH3），DIAPH 3 與DIAPH1（5q31.3）有51.3%的同源性，與DIAPH2（Xq22）有57.3%的同源性。其中，DIAPH1基因與常染色體顯性遺傳性非綜合征型感音神經性聾相關，DIAPH2與X－連鎖的卵巢功能早衰相關。人類DIAPH3 基因和蛋白與黑猩猩、獼猴、狗、牛、小鼠、大鼠及雞的同源核酸及蛋白質序列在進化分析上高度保守［20］。

Schoen等［12］應用RT－PCR 和Northern blot技術發(fā)現(xiàn)DIAPH3 基因是廣泛表達的。目前尚無DIAPH3 基因在內耳的精確表達模式和具體表達部位的報道。

2 DIAPH3基因的功能研究

天然狀態(tài)下DIAPH3蛋白通過細胞內FH3的DID（diaphanous inhibitory domain）結構域（即di－aphanous抑制區(qū)）和羧基端的DAD 區(qū)域間相互作用而使得其活性處于自抑制狀態(tài)［23，24］。當活化的Rho GTPase結合GBD 后，這種自抑制狀態(tài)被解除，暴露出FH2和DAD的功能區(qū)，使之活化而促進肌動蛋白的聚集成核、延伸、加帽及微絲的繼續(xù)伸長等（圖1），最終對細胞粘附、細胞運動、細胞形態(tài)發(fā)生、細胞內運輸、囊泡運輸?shù)绕鹬匾恼{控作用［25～27］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)GBD結構域決定DIAPH3蛋白的亞細胞定位，并影響囊泡和絲狀偽足的的活動［19］。

圖1 DIAPH3蛋白的結構域組成和分子內調節(jié)

Pawson等［28］在大規(guī)模篩查維持果蠅神經肌肉接頭生長和／或穩(wěn)定所必須的基因時，發(fā)現(xiàn)diaphanous是突觸生長的重要調控因子；對果蠅行免疫組織熒光分析發(fā)現(xiàn)，diaphanous蛋白既存在于神經肌肉接頭處的突觸前成分，也存在于其突觸后成分，同時發(fā)現(xiàn)diaphanous 蛋白作用于受體酪氨酸激酶Dlar的下游，通過調控神經肌肉接頭處突觸前膜的肌動蛋白和微管細胞骨架，最終影響神經肌肉接頭處的突觸的生長。

3 DIAPH3基因與ANSD

2004年Kim 等［29］報道了一個歐洲的常染色體顯性遺傳性ANSD 大家系，共研究了4代47人，均排除了顱神經和周圍神經病變，均為非綜合征型ANSD，其中2人經測序發(fā)現(xiàn)為純合突變，且與其余雜合突變的患者相比，除發(fā)病年齡較小外，臨床表現(xiàn)無明顯差異。Kim 等應用單體型分析發(fā)現(xiàn)18歲以上的患者外顯率均為100%。該家系平均發(fā)病年齡為18.6歲。發(fā)病年齡最小的患者外毛細胞功能正常（可引出正常的OAE），而聽力有損失（根據(jù)純音測聽和／或ABR 結果），后隨著時間的推移，OAE消失，且聽閾提高，最后發(fā)展為極重度感音神經性聾。Kim 等通過連鎖分析將該家系精確定位在13q14～21上的D13S153和D13S1317之間5.47厘摩的范圍，并將該位點命名為AUNA1，該家系命名為AUNA1家系［29］。

2010年，Starr等［30］進一步研究了AUNA1家系的臨床聽力學表型（表2），發(fā)現(xiàn)該家系的發(fā)病年齡為7～45歲，而在隨后的20年內逐漸進展為極重度感音神經性聾。該家系典型的癥狀為言語識別率明顯降低，有88%的患者反映言語理解能力下降，72%的患者反映在噪聲環(huán)境下言語理解能力進一步下降，72%的患者電話溝通有困難；38%的患者自覺助聽設備“有效”，可放大聲音，但不能提高言語識別率。該家系中3名患者行人工耳蝸植入術后，聽功能顯著提高，主要表現(xiàn)為電誘發(fā)聽性腦干反應（EABRs）、聽覺時間處理能力和言語識別率明顯改善。據(jù)此Starr等提出，該家系患者的病變部位主要在聽神經遠端，包括螺旋神經節(jié)的樹突棘末端、內毛細胞及二者之間的突觸，而螺旋神經節(jié)細胞及其軸突功能完好，屬于遠端ANSD，即II型ANSD。此外，因該家系聽力損失的類型從年輕時的ANSD轉為老年時的感音神經性聾，提示該家系的ANSD和感音神經性聾可能是同一疾病不同時期的病理過程。

表2 AUNA1家系的臨床聽力學特點

Schoen 等［12］研究AUNA1 家系時，對家系中一個親緣關系較遠的患者DNA 樣本行基因型分型，將AUNA1 基因座進一步縮窄到長度約為11Mb、3.28cM 的區(qū)域，其中包含PCDH17 、PCDH20、TDRD3和DIAPH3共4個基因。PCDH17、PCDH20、TDRD3 的測序分析未發(fā)現(xiàn)任何突變，DIAPH3基因的測序分析發(fā)現(xiàn)其5＇UTR 區(qū)高度保守的GC框有c.－172G＞A 的突變，且與ANSD 表型共分離。隨后應用微陣列基因表達技術，Schoen等發(fā)現(xiàn)受累患者淋巴母細胞系的DIAPH3基因的mRNA 較正常對照組過表達2～3倍。其中，雜合突變患者有2.11 倍的過表達，而純合突變患者有2.98倍的過表達；應用定量免疫印跡技術發(fā)現(xiàn)受累患者的淋巴母細胞系的DIAPH3蛋白較正常對照組有1.5倍的過表達，其中，雜合突變患者有1.48倍的過表達，而純合突變患者有1.62 倍的過表達［12］。Schoen等進一步將可能的啟動子和5，UTR區(qū)（突變型、野生型）克隆到一個熒光素酶報告載體上，觀察c.－172G＞A 突變對DIAPH3 基因表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)5，UTR 區(qū)c.－172G＞A 突變明顯上調了DIAPH3基因的表達，相對于野生型有約2～3倍的過表達，證實DIAPH3基因的5＇UTR 區(qū)對于轉錄調控有重要作用［12］。通過比較純合突變患者和正常對照組DIAPH3基因cDNA 的PCR 產物，Schoen等發(fā)現(xiàn)兩組的DIAPH3轉錄本無論是數(shù)量還是種類都無統(tǒng)計學差異，排除了DIAPH3基因的過表達是由不同轉錄本引起的這一猜想。為進一步研究diaphanous蛋白對聽覺系統(tǒng)的影響，Schoen建立了黑腹果蠅動物模型，其聽覺器官（Johnston’s organ，JO）可表達持續(xù)激活的diaphanous蛋白。實驗發(fā)現(xiàn)除少數(shù)果蠅死亡外，存活的果蠅聲誘發(fā)電位SEPs均顯著降低，約為0.25～0.75mV，而野生型果蠅的聲誘發(fā)電位為0.5～1.3mV，說明DIAPH3基因突變可影響聽覺器官的功能［12］。

通過上述一系列試驗，Schoen等證實DIAPH3基因是首個與非綜合征型顯性遺傳性ANSD 相關的基因［12］，其可能的致聾機制如下：DIAPH3基因的過表達影響螺旋神經節(jié)樹突棘的功能［31］，由于聽神經傳入纖維螺旋神經節(jié)樹突95%支配內毛細胞，5%分布于外毛細胞［32］，當螺旋神經節(jié)樹突棘存在缺陷時，起初內毛細胞受的影響更大，故病變早期，主要表現(xiàn)為中度聽力損失，ABR 缺失或者明顯異常，而DPOAE 和／或CMs存在。有文獻報道diaphanous蛋白參與調控神經肌肉接頭處突觸前成分的肌動蛋白和微管細胞骨架［30］，從而調節(jié)毛細胞的形態(tài)和靜纖毛的長度［33，34］。DIAPH3 基因過表達最終影響到內、外毛細胞的功能，表現(xiàn)為極重度聽力損失，ABR、DPOAE、CMs均引不出。因此，DIAPH3基因突變引起的ANSD 早期影響突觸后成分（螺旋神經節(jié)樹突棘），晚期逐漸累及突觸前成分（內、外毛細胞）［35］。

4 DIAPH3基因的篩查情況

Schoen等對AUNA1 家系4 代47 人行DIAPH3基因測序分析，發(fā)現(xiàn)DIAPH3基因5＇UTR 區(qū)高度保守的GC框有c.－172G＞A 的突變，并經一系列試驗證明其為 AUNA1 家系的致病突變［12，23，24］。盧新紅等［36］對一個現(xiàn)存3代9人的常染色體顯性遺傳性ANSD 核心家系所有成員行DIAPH3基因5＇UTR區(qū)測序分析，并對其中1例患者行DIAPH3基因全部編碼區(qū)篩查，結果無陽性發(fā)現(xiàn)。

自2004 年首次鑒定AUNA1 基因座，并于2008年發(fā)現(xiàn)AUNA1家系的致病基因（DIAPH3 基因）至今，僅在AUNA1家系中發(fā)現(xiàn)該基因的1種致病突變，即5＇UTR 區(qū)的c.－172G＞A 突變。目前，尚未在中國ANSD 患者及其他耳聾患者中發(fā)現(xiàn)該基因的突變。

5 展望

DIAPH3基因對細胞粘附、細胞運動、細胞形態(tài)發(fā)生、細胞內運輸、囊泡運輸?shù)绕鹬匾恼{控作用［27～29］，近年來，隨著分子遺傳學、細胞生物學、分子生物學、生物信息學等的發(fā)展，DIAPH3 基因及其對ANSD 影響的相關研究逐漸深入。然而尚有許多問題亟待解決，如DIAPH3 基因在內耳的精確表達模式和具體表達部位尚不清楚；5，UTR區(qū)c.－172G＞A 突變致DIAPH3 基因過表達的機制目前仍是個謎；DIAPH3 基因過表達如何導致ANSD 的機制仍停留在假說水平，并且DIAPH3基因的長期效應還有待進一步研究。DIAPH3 基因的相關研究將為ANSD 的發(fā)病機理、病理分型、治療方式的選擇、預后及可能的基因治療奠定理論基礎。

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