高燕 楊一兵 叢林海 湯勇 張帆

中耳膽脂瘤是耳科常見疾病，目前公認(rèn)是機體防御慢性炎癥引起的一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)之一，主要表現(xiàn)為中耳腔內(nèi)有大量高度增生的角化鱗狀上皮以及對周圍骨質(zhì)的破壞，其中膽脂瘤上皮細(xì)胞的移行、高度增殖及骨質(zhì)破壞是該病的重要特征。近年來不少研究顯示［1，2］單核細(xì)胞趨化因子（monocyte chemotactic factor，MCP－1）和纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）在炎性細(xì)胞的趨化激活及角質(zhì)形成細(xì)胞的遷徙中起著重要作用，但其與中耳膽脂瘤的相關(guān)性鮮見報道。本研究通過免疫組化MaxVisionTM法檢測MCP－1和FN 在中耳膽脂瘤上皮及正常耳后皮膚組織中的表達(dá)，結(jié)合病例組術(shù)前CT和術(shù)中所見聽小骨及周圍骨質(zhì)的破壞程度，探討它們在膽脂瘤侵襲及上皮遷徙過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 中耳膽脂瘤上皮標(biāo)本30例，為昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010年8月～2012年8月手術(shù)、經(jīng)病理檢查證實為中耳膽脂瘤的石蠟標(biāo)本，臨床診斷均為后天繼發(fā)性膽脂瘤，其中，男17例，女13例；年齡12～64歲，平均39.33±17.68歲；左耳12例，右耳18 例；病程1～60 年，平均16.00±15.82年。膽脂瘤患者耳后皮膚標(biāo)本20例，為行乳突根治術(shù)中所取耳后正常皮膚標(biāo)本，其中，男14例，女6例；年齡13～56歲，平均35.05±12.80歲；左耳12例，右耳8 例；病程2～40 年，平均16.00±10.46年。非膽脂瘤患者耳后皮膚標(biāo)本16例，為耳廓外傷患者行清創(chuàng)縫合術(shù)或外傷性鼓膜穿孔患者行耳后徑路Ⅰ型鼓室成型術(shù)時所取耳后正常皮膚標(biāo)本。

1.2 主要試劑 兔抗人MCP－1多克隆抗體與兔抗人Fibronectin多克隆抗體均購自武漢博士德公司，兩種抗體的滴度均為1：100。即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒及DAB 顯色試劑盒購自福州邁新公司。

1.3 免疫組化染色方法 標(biāo)本經(jīng)常規(guī)甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，厚約4μm。采用免疫組化Max－VisionTM對實驗標(biāo)本染色，嚴(yán)格按照MaxVisionTM試劑盒說明書操作，步驟如下：切片常規(guī)脫蠟和水化后，枸櫞酸溶液中高溫高壓修復(fù)抗原，經(jīng)內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育10 min。依次加入一抗（多抗MCP－1和FN）4 ℃過夜，滴加MaxVisionTM試劑37℃孵育20min，DAB顯色后，復(fù)染、脫水、透明和封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫組化結(jié)果判定

1.4.1 陽性標(biāo)準(zhǔn)：MCP－1和FN 陽性細(xì)胞主要在胞漿、胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著，部分在膽脂瘤組織的基質(zhì)中。組織分層：膽脂瘤上皮和正常耳后皮膚上皮層分為基底層（basal layer）、棘層（spinous layer）、顆粒層（granular layer）和角質(zhì)層（straum corneum）［3］。膽脂瘤上皮的外周部分是膽脂瘤基質(zhì)，由一層厚薄不一的纖維組織與鄰近的骨壁或組織相連［4］。

1.4.2 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

①人工計數(shù)：在高倍鏡下（×400 倍），每張切片隨機選擇5個不重疊視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞，計算5個視野陽性細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)。根據(jù)顯色范圍分為陰性（－）：陽性細(xì)胞＜5%；弱陽性（＋）：陽性細(xì)胞占5%～25%；中度陽性（＋＋）：陽性細(xì)胞占26%～50%；強陽性（＋＋＋）：陽性細(xì)胞＞50%。

②灰度值測定：應(yīng)用高清晰彩色病理圖像免疫組化測量系統(tǒng)（HMIAS－2000）進(jìn)行免疫組化圖像分析，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)灰度校正后，隨機每張切片取3個陽性視野，測定膽脂瘤組織中MCP－1及FN 的平均灰度值，灰度值隨陽性表達(dá)量的增多而減小。

③中耳膽脂瘤侵襲能力評定［5］：術(shù)前CT 及術(shù)中觀察膽脂瘤病變范圍及聽小骨破壞程度，按膽脂瘤上皮侵襲程度分成4組：①無明顯聽小骨破壞者為（＋）；②破壞砧骨者為（＋＋）；③破壞錘骨和砧骨者為（＋＋＋）；④破壞乳突天蓋和／或乙狀竇骨板者為（＋＋＋＋）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件對人工計數(shù)結(jié)果采用完全隨機設(shè)計四格表χ2檢驗；對灰度值檢測結(jié)果采用單樣本方差分析。膽脂瘤的侵襲能力與MCP－1 和FN 表達(dá)蛋白的灰度值采用Spearman等級相關(guān)分析；最后采用Pearson直線相關(guān)分析判斷MCP－1和FN 蛋白在膽脂瘤中的表達(dá)是否有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 MCP－1和FN 在中耳膽脂瘤、非膽脂瘤患者耳后正常皮膚及膽脂瘤患者耳后正常皮膚中的表達(dá) 非膽脂瘤患者耳后正常皮膚和膽脂瘤患者耳后正常皮膚中MCP－1陽性表達(dá)呈弱陽性，為淡黃色顆粒，陽性表達(dá)率分別為37.5%和35.0%（圖1、2），兩者陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。中耳膽脂瘤上皮中MCP－1陽性表達(dá)位于上皮全層，以棘層表達(dá)密度較高，顆粒較粗，表達(dá)呈強陽性，為深棕色顆粒，陽性率為70%（圖3），與兩組耳后正常皮膚比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均為P＜0.05）。非膽脂瘤患者耳后正常皮膚和膽脂瘤患者耳后正常皮膚上皮層中，F(xiàn)N 陽性表達(dá)率分別為31.3%和30.0%（圖4、5），兩者陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。中耳膽脂瘤上皮中FN 陽性表達(dá)位于上皮全層（基底層、棘層、顆粒層細(xì)胞及基質(zhì)），表達(dá)密度較高，顆粒較粗，表達(dá)呈強陽性，為深棕色顆粒，陽性率為76.7%（圖6），與兩組耳后正常皮膚相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均為P＜0.05）。

2.2 中耳膽脂瘤上皮中MCP－1和FN 陽性表達(dá)的灰度值與中耳膽脂瘤侵襲能力的關(guān)系 MCP－1和FN 在三種組織類型中陽性表達(dá)的灰度值比較見表1，MCP－1或FN 在膽脂瘤上皮組中的表達(dá)灰度值低于膽脂瘤患者和非膽脂瘤患者耳后正常皮膚組中的表達(dá)灰度值，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而膽脂瘤患者和非膽脂瘤患者耳后正常皮膚中MCP－1或FN 的表達(dá)灰度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。采用Spearman 等級相關(guān)分析顯示膽脂瘤侵襲能力與MCP－1陽性表達(dá)灰度值有相關(guān)性（rmcp－1=－0.682，P＜0.01），與FN 表達(dá)亦有相關(guān)性（rfn=－0.531，P＜0.01）。

2.3 中耳膽脂瘤上皮中MCP－1和FN 表達(dá)的相關(guān)性 采用Pearson直線相關(guān)分析，MCP－1和FN之間無線性相關(guān)關(guān)系（tr=0.332，P＞0.05）。

圖1 MCP－1在非膽脂瘤患者正常耳后皮膚中表達(dá)呈弱陽性（＋）（免疫組化×400）圖2 MCP－1在膽脂瘤患者正常耳后皮膚中表達(dá)呈弱陽性（＋）（免疫組化×400）圖3 MCP－1在膽脂瘤上皮中表達(dá)呈強陽性（＋＋＋）（免疫組化×400）圖4 FN 在非膽脂瘤患者正常耳后皮膚中表達(dá)呈弱陽性（＋）（免疫組化×400）圖5 FN 在膽脂瘤患者正常耳后皮膚中表達(dá)呈弱陽性（＋）（免疫組化×400）圖6 FN 在膽脂瘤上皮中表達(dá)呈強陽性（＋＋＋）（免疫組化×400）

表1 不同組織中MCP－1和FN 表達(dá)灰度值的比較（±s）

表1 不同組織中MCP－1和FN 表達(dá)灰度值的比較（±s）

組織類型例數(shù)MCP－1 平均灰度值 F P FN 平均灰度值 F P 30 147.2±20.1 139.2±18.5膽脂瘤患者耳后正常皮膚20 200.8±18.4 60.5＜0.001 195.0±12.9 95.8＜0.001非膽脂瘤患者耳后正常皮膚膽脂瘤上皮16 193.3±15.5 191.6±13.5

3 討論

膽脂瘤雖然不是真正的腫瘤，卻有著類似腫瘤的生物學(xué)特性，具有進(jìn)行性生長及侵襲破壞局部骨組織的能力，其危害主要取決于周圍骨質(zhì)的破壞程度，如果能夠明確其破壞骨質(zhì)的機制，將對膽脂瘤的治療有重要意義。慢性中耳炎在膽脂瘤的發(fā)病機制中有一定作用，其引起骨質(zhì)破壞與免疫反應(yīng)密切相關(guān)［6］。MCP－1對單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、CD4＋、CD8＋、T 淋巴細(xì)胞及NK 細(xì)胞具有趨化激活雙重功能，使各種炎性細(xì)胞尤其是單核細(xì)胞向病變部位聚集，誘導(dǎo)這些細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子和溶酶體酶，并產(chǎn)生IL－1、IL－6及腫瘤壞死因子－α（TNF－α）等炎性因子，而表皮生長因子（EGF）、脂多糖（LPS）、IL－1β、IL－4、TNF－α、γ干擾素（IFN－γ）等又能夠誘導(dǎo)這些細(xì)胞產(chǎn)生MCP－1，形成惡性循環(huán)，從而引起組織損傷。FN 能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞移動，還能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的遷徙，而單核巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均能產(chǎn)生膠原酶，在骨質(zhì)破壞中起到重要的作用。

本研究結(jié)果顯示，MCP－1主要在中耳膽脂瘤上皮棘細(xì)胞層和顆粒層中表達(dá)，F(xiàn)N 主要在上皮基底層和基質(zhì)中表達(dá)，MCP－1和FN 在膽脂瘤上皮組織中異常增高，與膽脂瘤患者及非膽脂瘤患者耳后正常皮膚相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明膽脂瘤上皮具有趨化炎性細(xì)胞和高度遷徙能力。MCP－1和FN 在膽脂瘤患者和非膽脂瘤患者耳后皮膚之間的陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），說明膽脂瘤上皮的趨化炎性細(xì)胞和高度遷徙能力只在膽脂瘤中體現(xiàn)，而在其他部位與正常人無異，與Helgaland等［7］、Schilling等［8］和Chao等［9］的研究結(jié)果相似；膽脂瘤的侵襲能力與MCP－1和FN 陽性蛋白的灰度值之間呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），而灰度值越低，陽性表達(dá)越高，說明膽脂瘤上皮的侵襲能力與MCP－1和FN 陽性表達(dá)呈正相關(guān)，MCP－1和FN 表達(dá)越強，膽脂瘤上皮的侵襲能力越強，膽脂瘤上皮中MCP－1和FN 的表達(dá)水平可能可以作為評估膽脂瘤上皮侵襲能力的指標(biāo)，但MCP－1和FN 陽性表達(dá)之間并不存在線性相關(guān)關(guān)系。

MCP－1和FN 在中耳膽脂瘤上皮和基質(zhì)中的異常表達(dá)可能在膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，炎性細(xì)胞浸潤、膽脂瘤上皮高遷徙能力可能參與了中耳膽脂瘤角化復(fù)層鱗狀上皮侵襲的機制。目前手術(shù)切除是治療中耳膽脂瘤唯一有效治療方法，但存在一定的復(fù)發(fā)率及并發(fā)癥，且術(shù)后部分患者的聽力無法恢復(fù)，能否以MCP－1和FN 為靶點研究局部用藥，以延緩或阻止膽脂瘤上皮的侵襲能力，或者使膽脂瘤的角化復(fù)層鱗狀上皮轉(zhuǎn)變成非角化復(fù)層鱗狀上皮及其他類型的上皮，從而阻止膽脂瘤的生長，可能是將來研究的方向之一。

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7 Helgaland T，Engelen B，Olsnes C.In vitro cholesteatoma growth and secretion of cytokines［J］.Acta Oto－Laryngologica，2010，130：815.

8 Schilling V，Holly A，Bujia J.High levels of fibronectin in the stroma of aural cholesteatoma［J］.American Journal of Otolaryngology，1995，16：232.

9 Chao WY，Yuan QG，Huang CC.Localization of fibronectin in human middle ear cholesteatoma［J］.Arch Otorhinolaryngol，1988，245：160.