莊雪儀，李 玲，李愛香

2.河南省人口與計劃生育科學(xué)研究院 生殖科，鄭州450052

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢。苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白－1（Bub1）和有絲分裂阻滯缺陷蛋白－2（Mad2）蛋白是紡錘體關(guān)卡的重要組成部分，其功能是監(jiān)控細胞有絲分裂，保證其過程忠實有序的進行。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測Bub1和Mad2蛋白在人正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)膜癌中的表達情況，并分析其與子宮內(nèi)膜癌患者的臨床分期、病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，探討其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2009年6月－2012年6月確診為子宮內(nèi)膜癌的手術(shù)切除存檔蠟塊標本72例，為子宮內(nèi)膜癌組（A組），年齡（50.37±4.54）歲（42～57歲），其中絕經(jīng)患者58例。病理類型：內(nèi)膜樣腺癌46例，腺癌伴鱗狀上皮化生16例，漿液性腺癌9例，透明細胞癌1例；臨床分期：Ⅰ期43例，Ⅱ期19例，Ⅲ期7例，Ⅳ期3例；病理分級：G1（高分化）43例，G2（中分化）20例，G3（低分化）9例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例。選取同期子宮內(nèi)膜不典型增生石蠟包埋組織標本40例，為不典型增生組（B組），年齡（47.87±5.32）歲；正常子宮內(nèi)膜石蠟包埋組織標本40例，為正常子宮內(nèi)膜組（C組），年齡（48.63±3.80）歲。3組間年齡差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。所有患者術(shù)前均未接受激素治療、放療或化療。

1.2 方法

1.2.1 試劑 一抗兔抗人多克隆抗體Bub1和Mad2（工作濃度為1∶100，美國Abcom公司）；SP試劑盒和DAB顯色劑（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2 檢測方法及判斷標準 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測各組中Bub1和Mad2蛋白的表達情況，子宮內(nèi)膜腺上皮細胞胞質(zhì)和／或胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達。判定標準：采用半定量、2人雙盲法觀察結(jié)果，每例切片選擇10個高倍視野（10×40），按照陽性細胞數(shù)占視野中總細胞數(shù)的百分比分為4級：無陽性著色或陽性細胞數(shù)≤10%為（－），11% ～30% 為 （＋），31% ～50% 為 （），≥51%為（）；（－）為陰性表達，（＋）～（）為陽性表達[1]。若2人觀察結(jié)果相差10%則重新評定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理。定性資料比較采用χ2檢驗，Bub1和Mad2蛋白的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析，α＝0.05設(shè)為檢驗水準。

2 結(jié) 果

2.1 Bub1和 Mad2蛋白檢測結(jié)果 A，B，C組Bub1蛋白的陽性表達率分別為27.78%，57.50%，85.00%；Mad2蛋白的陽性表達率分別為86.11%，57.50%，22.50%；2種蛋白3組間兩兩比較差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 Bub1及Mad2蛋白的表達與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Bub1蛋白在臨床分期為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ期的患者中的陽性表達率比較差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而 Mad2蛋白則無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；2種蛋白在病理分級為 G1，G2，G3的患者中陽性表達率差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者中，Bub1蛋白的陽性表達率分別為0%及31.75%，Mad2蛋白的陽性表達率分別為88.89%及85.71%，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1，表1）。

圖1 子宮內(nèi)膜癌組織中Bub1及Mad2蛋白的表達（DAB染色 ×400）Fig 1 Immunohistochemical figure of Bud1and Mad2（DAB ×400）

表1 Bub1及Mad2蛋白的表達與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)關(guān)系Tab 1 Parameter relationship between positive expression rate of Bub1and Mad2and clinical stage，pathology classification and lymph node etastasis

2.3 Bub1和Mad2蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的相關(guān)性分析 2種蛋白在子宮內(nèi)膜癌組中均為陽性表達的有13例，均為陰性的有3例。根據(jù)其陽性細胞數(shù)占視野中總細胞數(shù)的百分比，二者在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達呈負相關(guān)（P＜0.01，表2）。

表2 子宮內(nèi)膜癌組織中Bub1和Mad2的相關(guān)性Tab 2 The correlation of Bub1and Mad2

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病年齡逐漸年輕化且發(fā)病率呈顯著上升趨勢。近年來的研究表明，細胞周期調(diào)控紊亂與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[2]。Bub1和Mad2蛋白是紡錘體關(guān)卡的重要組成部分，在細胞有絲分裂過程中監(jiān)控紡錘體形態(tài)、染色體著絲點與微管聯(lián)接以及染色體位置和排列，如果其表達和／或功能異常時，紡錘體關(guān)卡就會忽略染色體損傷，繼續(xù)有絲分裂周期，染色體分配過程就有可能發(fā)生錯誤，造成染色體的不穩(wěn)定性[1]。

本研究結(jié)果表明，Bub1蛋白主要定位于細胞質(zhì)，其在子宮內(nèi)膜癌患者中的陽性表達率明顯低于正常子宮內(nèi)膜，且內(nèi)膜癌的分化程度越低、臨床分期越晚，陽性表達率越低，但與是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，提示Bub1蛋白表達可能與內(nèi)膜癌預(yù)后相關(guān)。Bub1基因發(fā)生突變的機率極低，Bub1蛋白在內(nèi)膜癌組織中表達降低，可能由于癌組織中Bub1的上游基因發(fā)生突變而導(dǎo)致Bub1表達降低，Bub1表達缺乏會導(dǎo)致P53介導(dǎo)的受損細胞早期凋亡通路中紡錘體關(guān)卡功能受損，導(dǎo)致非整倍體染色體的形成和積累[3]。有研究表明，內(nèi)膜癌組織中非整倍體染色體細胞率明顯高于不典型增生和正常子宮內(nèi)膜組織，非整倍體可以獨立于基因突變而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[4－5]。

本研究也顯示，Mad2蛋白在子宮內(nèi)膜癌患者中的陽性表達率明顯高于正常子宮內(nèi)膜，且子宮內(nèi)膜癌的分化程度越低，陽性表達率越高，但與臨床分期和是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。Mad2蛋白同樣以細胞質(zhì)表達為主，在細胞有絲分裂過程中可以調(diào)節(jié)細胞周期蛋白，使細胞進行染色體的分離[6]。Mad2基因也極少發(fā)生突變，可能是由于某種或多種因素導(dǎo)致Mad2蛋白在內(nèi)膜癌中表達增高，繼而使紡錘體檢測點功能受損，引起紡錘體檢查點控制失常，導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性增加，染色體缺失的機率升高[7]。Sotillo等研究表明，Mad2過表達可以刺激小鼠體內(nèi)不同亞型腫瘤的啟動和進展[8]。

本研究結(jié)果還表明，Bub1和Mad2蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達呈負相關(guān)。Bub1是Bub家族的成員之一，基因定位于2q14，其表達產(chǎn)物是紡錘體關(guān)卡的必要組分。Bub1蛋白是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，在各種生物中，Bub1是招募 Mad1、Mad2、蛋白瞵酸酶（PP）等到動點所必須的。Bubl蛋白表達異常會使紡錘體關(guān)卡功能受損，導(dǎo)致細胞有絲分裂過程中染色體分配錯誤，造成非整倍體和染色體不穩(wěn)定性（Chromosomeinstability，CIN）的產(chǎn)生[9]。Mad2是Mad家族的成員之一，其基因定位于4q27，Mad2蛋白是紡錘體關(guān)卡的必要組成部分，其位于游離染色體著絲點上，參與監(jiān)控著絲點與紡錘體微管的聯(lián)接，并發(fā)出聯(lián)結(jié)缺損信號。在信號級聯(lián)中，Bub1位于信號級聯(lián)的上游，為Mad2檢測張力動粒所必須。當染色體受到損傷，紡錘體關(guān)卡被激活，Mad2通過抑制后期促進復(fù)合體的活性，阻止細胞向后期轉(zhuǎn)變[10]。Bub1表達降低，使Mad2定位動粒的能力降低，忽略染色體的異常，加快有絲分裂的進程[11]。Bub1和 Mad2蛋白均表達異常，可能會加重染色體不穩(wěn)定的發(fā)生，具有染色體不穩(wěn)定性質(zhì)的細胞易于發(fā)生染色體畸變，最終可能會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，Bubl和Mad2蛋白表達異常會造成染色體不穩(wěn)定和非整倍體細胞，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，二者相互作用，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程起重要作用。因此聯(lián)合檢測兩個指標較單一檢測其中某一個指標更具有臨床意義。

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