洪志勇李玉芳，2李 明張興峰林秀嬌李鴻翔莊益芬張文昌*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 福州 350002；2.黃淮學(xué)院 河南駐馬店 463000）

鵪鶉屬于鳥類，是高等脊椎動(dòng)物，與其他動(dòng)物相比，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為依托的禽類生物反應(yīng)器有著巨大的經(jīng)濟(jì)效益。然而，鵪鶉在長期的生物進(jìn)化中，形成了自己獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu)與生活習(xí)性，尤其是其獨(dú)特的生殖解剖和生殖生理特點(diǎn)，完全不同于哺乳動(dòng)物的特殊生殖模式，使得現(xiàn)有的應(yīng)用于哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移方法不能完全套用，須在深入了解禽類具體的生理特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移策略進(jìn)行創(chuàng)新和改進(jìn)。

制備轉(zhuǎn)基因鵪鶉，通過對(duì)轉(zhuǎn)基因鵪鶉蛋中的蛋清蛋白進(jìn)行分析，是檢測構(gòu)建的表達(dá)載體有效與否的最準(zhǔn)確的方法，但是轉(zhuǎn)基因鵪鶉的制備需要耗費(fèi)大量的人力、物力，并且試驗(yàn)周期長，步驟繁瑣，在試驗(yàn)過程中，不同的轉(zhuǎn)基因個(gè)體也存在著很大差異，也會(huì)對(duì)表達(dá)的結(jié)果造成許多偏差。通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以彌補(bǔ)以上不足，首先對(duì)輸卵管上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，通過檢測外源基因在輸卵管上皮細(xì)胞上的表達(dá)來驗(yàn)證表達(dá)載體構(gòu)建及目的基因表達(dá)的正確性。相對(duì)于轉(zhuǎn)基因的個(gè)體而言，該方法簡單，結(jié)果明確，試驗(yàn)周期短，常用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物前對(duì)載體各元件功能的檢測和篩選。

Ochiai等［1-2］將 1.35 kb 的卵清蛋白基因 5’調(diào)控區(qū)調(diào)控的人促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因通過電穿孔法導(dǎo)入原代輸卵管上皮細(xì)胞，探討了hEPO基因轉(zhuǎn)錄的可能性；接著又用電脈沖法導(dǎo)入活雞的輸卵管上皮細(xì)胞，證明了hEPO在輸卵管內(nèi)表達(dá)的可能性。宇麗等［3］把1.1 kb的卵清蛋白5’端調(diào)控區(qū)調(diào)控的CAT基因通過脂質(zhì)體技術(shù)，轉(zhuǎn)染雞原代輸卵管上皮細(xì)胞和雞成纖維細(xì)胞，結(jié)果在雞原代輸卵管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后表達(dá)量最高；而在雞成纖維細(xì)胞，不論有無類固醇存在，均不表達(dá)。結(jié)果說明，在輸卵管細(xì)胞中存在細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子。

20世紀(jì)60年代Banghan發(fā)明了脂質(zhì)體，Robert在80年代初將脂質(zhì)體用于質(zhì)粒的包裹，1987年美國生命技術(shù)公司推出了合成的脂質(zhì)體試劑，使之廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法具有可重復(fù)、持續(xù)、高效、易操作，對(duì)細(xì)胞毒害作用小，不受外源基因大小及細(xì)胞種類(指動(dòng)物細(xì)胞)的限制，體內(nèi)外都有較高的轉(zhuǎn)染效率等優(yōu)點(diǎn)［4-6］，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備研究中深受歡迎，應(yīng)用越來越廣泛，尤其是近幾年發(fā)展得更快，己成為動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常規(guī)方法。但該方法尚存在穩(wěn)定性及核酸包裹率等問題也不能用于帶壁細(xì)胞，仍需進(jìn)一步完善。

試驗(yàn)選擇培養(yǎng)2種細(xì)胞對(duì)構(gòu)建的載體進(jìn)行檢測，篩選出陽性細(xì)胞，目的是通過將構(gòu)建的人血清白蛋白表達(dá)載體在這兩種鵪鶉自身的細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后提取基因組DNA用PCR方法和SDSPAGE方法來對(duì)構(gòu)建的蛋白表達(dá)載體的有效性進(jìn)行檢測和篩選。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒 日本鵪鶉及幼雛由本研究室飼養(yǎng)和孵化；人血清白蛋白基因真核熒光表達(dá)載體：pEGFP-VH。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生物工程公司；胎牛血清、DMEM-F12培養(yǎng)液均購自廈門泰京生物公司；Lipofectin TM Reagent購自Introgen公司；雌二醇、皮質(zhì)酮、胰島素均購自華美公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒pEGFP-VH的純化 從37℃培養(yǎng)16～20 h的新鮮培養(yǎng)板中挑取1個(gè)大腸桿菌單菌落，轉(zhuǎn)到含有100 mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)16～24 h，提取質(zhì)粒并純化。

1.2.2 鵪鶉輸卵管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng) 取4日齡鵪鶉幼雛，連續(xù)10 d飼喂15 mg乙烯雌酚（DES），然后撤掉DES，1周后改為連續(xù)15 d飼喂25 mgDES，在幼雛處死之前48 h撤掉DES。處死幼雛，取輸卵管膨大部分，剪成 1～2 mm 碎塊（凈重 0.5～1 g），在40 mL 解離液(F12)中孵育 30 min。放置 2～3 min，去除上清液。其余部分加入新鮮的解離液，繼續(xù)孵育30 min。靜置2～3 min后，將上清液移入50 mL離心管中，加入胎牛血清，離心5 min，清洗沉淀2次。最后將細(xì)胞重新懸浮在無血清DMEM-F12（1：1）混合培養(yǎng)液中（含抗生素和0.1%BSA），以1×106ce11/孔接種到24孔培養(yǎng)板，立即轉(zhuǎn)染。

1.2.3 鵪鶉成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

1)胚胎的采取。取10日齡鵪鶉胚胎，氣室端用5%碘酒消毒，敲開一小口，用鑷子將胚胎取出，置于無菌平皿內(nèi)（事先放入PBS液）。去頭、內(nèi)臟和四肢。

2)成纖維細(xì)胞的分離。用Hanks去除血細(xì)胞、色素物質(zhì)及細(xì)胞碎片后，移入鏈霉素小瓶內(nèi)，剪成1～2 mm碎塊。再用PBS液洗2～3次。加入500μL 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混勻后，37℃消化10 min，過濾，將上清液離心(600 r/min、10 min)，棄上清液，再用DMEM-F12培養(yǎng)液懸浮沉淀，過濾，移至另一離心管中，離心(1 500 r/min、5 min)，培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，取沉淀物加營養(yǎng)液(含3%小牛血清)，于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。

3)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)。將成纖維細(xì)胞稀釋成5×105/mL左右放入100 mL培養(yǎng)瓶中，加入10 mL培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2、濕度75%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后倒掉營養(yǎng)液，用PBS洗2次，去除雜質(zhì)細(xì)胞，每24 h更換營養(yǎng)液。待細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)倒棄營養(yǎng)液，再用PBS溶液洗滌細(xì)胞，加入1 mL消化液，室溫消化1 min，在顯微鏡下觀察到梭形細(xì)胞纖維消失、大部分細(xì)胞收縮成圓球形時(shí)，加入2 mL含15%FBS的培養(yǎng)液，混勻，終止消化。將消化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至離心管中，3 000 r/min離心5 min后棄上清，加入DMEM-F12培養(yǎng)液，離心洗滌2次后，加1 mL營養(yǎng)液混勻，顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，放入37℃、5%CO2、濕度75%的二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 轉(zhuǎn)染 制備DNA-Lipofectamine（即 DNA-脂質(zhì)體）混合物（30 min內(nèi)完成），并設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)染HAS基因的試驗(yàn)組、對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的輸卵管上皮細(xì)胞組。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞放到50 mL離心管中離心5 min。再以DMEM-F12懸浮細(xì)胞，離心棄上清液。加入含有10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液、10-7mo1/L雌二醇、10-6mo1/L皮質(zhì)酮、40 ug/L胰島素，加培養(yǎng)液至3 mL，37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。

1.2.5 觀察與檢測 轉(zhuǎn)化的細(xì)胞用熒光顯微鏡觀察，收集細(xì)胞及上清液，檢測轉(zhuǎn)染水平。每隔12 h將其置于倒置熒光顯微鏡上觀察pEGFP-VH質(zhì)粒在鵪鶉原代輸卵管上皮細(xì)胞和鵪鶉成纖維細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)。待轉(zhuǎn)染72 h收集細(xì)胞上清液。

1.2.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞外源基因表達(dá)的初步檢測 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鵪鶉輸卵管上皮細(xì)胞采用PCR檢測和HSA蛋白表達(dá)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵪鶉輸卵管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及其轉(zhuǎn)染結(jié)果

試驗(yàn)獲得的鵪鶉輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng)16 h時(shí)，細(xì)胞開始貼壁；48 h后細(xì)胞增多，貼壁上皮細(xì)胞蔓延生長，呈圓形或條狀；72 h后細(xì)胞增長緩慢，體積變大，少數(shù)細(xì)胞脫落死亡。見圖1-圖2。

圖1 原代培養(yǎng)的鵪鶉輸卵管上皮細(xì)胞

圖2 HSA真核表達(dá)載體在鵪鶉原代輸卵管上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 鵪鶉成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染結(jié)果 試驗(yàn)分離的鵪鶉成纖維細(xì)胞及其細(xì)胞核均呈圓形或橢圓形，細(xì)胞前期貼壁生長良好，呈梭形（傳代后1 d），生長速度快，DMEM-F12培養(yǎng)液（含10%FBS）能很好地維持其生長需要，接種后2 h左右開始貼壁生長，2～3 d即可鋪滿瓶底，經(jīng)過3～5次傳代后，生長速度明顯變慢，體積成不規(guī)則狀，見圖3。pEGFPVH在鵪鶉胚胎成纖維細(xì)胞中48 h時(shí)未見綠色熒光表達(dá)。

圖3 鵪鶉胚胎成纖維細(xì)胞

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞外源基因表達(dá)的初步檢測 提取轉(zhuǎn)染的、未轉(zhuǎn)染的和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的輸卵管上皮細(xì)胞基因組DNA，PCR檢測顯示僅在轉(zhuǎn)染組擴(kuò)增獲得約1 900 bp的片段，而對(duì)照組無此條帶，說明HSA基因已經(jīng)穩(wěn)定整合到輸卵管上皮細(xì)胞基因組中（見圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞PCR檢測結(jié)果

2.4 HSA表達(dá)檢測結(jié)果 在分泌表達(dá)載體轉(zhuǎn)染鵪鶉輸卵管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞上清液，用鹽析方法沉淀蛋白，透析、濃縮，最后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測蛋白成分。結(jié)果顯示，僅在轉(zhuǎn)染HSA基因的鵪鶉輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液上清中出現(xiàn)了分子量約68 kDa的蛋白條帶，而在未轉(zhuǎn)染的和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的鵪鶉輸卵管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液上清中未見目的蛋白條帶，結(jié)果見圖4-圖5。

圖5 HSA蛋白的SDS-PAGE結(jié)果(銀染色)

3 討論

本試驗(yàn)通過脂質(zhì)體陽離子介導(dǎo)方法將HAS基因?qū)氲靳g鶉輸卵管上皮細(xì)胞成纖維細(xì)胞，在培養(yǎng)48 h后熒光顯示。輸卵管生物反應(yīng)器的研究是從輸卵管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)以及在培養(yǎng)的輸卵管細(xì)胞內(nèi)和在活雞的輸卵管內(nèi)研究外源基因的表達(dá)開始的。1967年Ma11ey等首先進(jìn)行了雞輸卵管組織的培養(yǎng)，雖然輸卵管能貼壁成單層的細(xì)胞，但生長緩慢。最初培養(yǎng)輸卵管細(xì)胞的目的并不是用來制作生物反應(yīng)器，1978年Mcknight等用輸卵管細(xì)胞來研究抗生物素蛋白。Sa11y等［7］首先研究成功雞輸卵管細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，輸卵管細(xì)胞能快速增殖，并被誘導(dǎo)表達(dá)了白蛋白。

目前，研制生物反應(yīng)器，需要供受體動(dòng)物的數(shù)量較多，試驗(yàn)周期較長，研制成本較高［8］。為了減少試驗(yàn)的盲目性、縮短試驗(yàn)周期和降低成本，不同的轉(zhuǎn)基因個(gè)體也存在著很大差異，也會(huì)對(duì)表達(dá)的結(jié)果造成許多偏差。有必要在動(dòng)物轉(zhuǎn)基因之前，利用一些簡便、經(jīng)濟(jì)、客觀的方法對(duì)基因的表達(dá)特性進(jìn)行初步驗(yàn)證。目前常用的方法有細(xì)胞表達(dá)分析法和轉(zhuǎn)基因小鼠分析法。禽類輸卵管生物反應(yīng)器成功的關(guān)鍵在于使用卵清蛋白調(diào)控元件，構(gòu)建合理有效的輸卵管組織特異性表達(dá)載體。因此，表達(dá)載體構(gòu)建的合理性和有效性，快速檢測系統(tǒng)的建立對(duì)于這一研究領(lǐng)域具有重要意義。禽類輸卵管上皮細(xì)胞是研究乳蛋白基因表達(dá)及調(diào)控的理想細(xì)胞模型。體外適當(dāng)條件下培養(yǎng)的原代輸卵管上皮細(xì)胞能保持原有的細(xì)胞分化和表達(dá)能力，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染方法將外源基因?qū)氲郊?xì)胞中，通過提取基因組DNA、PCR方法檢測外源基因整合到細(xì)胞的情況；蛋白水平檢測，主要通過SDS-PAGE檢測外源蛋白的分泌表達(dá)。

顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況，輸卵管上皮細(xì)胞中有表達(dá)報(bào)告基因GFP的細(xì)胞，分泌型的EGFP在細(xì)胞質(zhì)中分布不均，呈斑點(diǎn)狀存在，熒光強(qiáng)度參差不齊，細(xì)胞核不易分辨，這可能與分泌型蛋白在細(xì)胞質(zhì)網(wǎng)膜系統(tǒng)中運(yùn)轉(zhuǎn)有關(guān)。而在鵪鶉成纖維細(xì)胞中未見清晰的熒光表達(dá)細(xì)胞，這可能是成纖維細(xì)胞缺乏卵清蛋白調(diào)控序列所需的凡是作用因子有關(guān)。宇麗等［9］將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因與克隆的雞卵清蛋白上游5’調(diào)控區(qū)1.1 kb的序列融合，構(gòu)建了表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染雞原代輸卵管上皮細(xì)胞和雞成纖維細(xì)胞，結(jié)果在雞成纖維細(xì)胞上，不論有無類固醇激素存在，均不表達(dá)；而在雞原代輸卵管上皮細(xì)胞上，轉(zhuǎn)染后48 h表達(dá)量最高，為 0.67 μg/L。Dierich等［10］用纖維注射的方法將含有卵清蛋白5’調(diào)控序列的質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)入多種細(xì)胞，結(jié)果外源基因也不在雞胚成纖維細(xì)胞、腎細(xì)胞和其他非雞源細(xì)胞中表達(dá)。這與本試驗(yàn)的結(jié)果是一致的。

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