林曾歡林碧芬黃志堅

（1.福清市畜牧獸醫(yī)中心 福建福清 350300；2.福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013；3.福建農林大學動物科學學院 福州 350002）

蟛蜞菊（Wedelia chinensis），為菊科(compositae)蟛蜞菊屬(wede1ia)植物，多年生草本，《中藥大辭典》記載：清熱、解毒、祛癖、消腫，主治白喉、百日咳、痢疾、痔瘡、跌打損傷［1］。蟛蜞菊已作為草藥在中國南方民間被廣泛應用，特別在福建和廣東地區(qū)。其不僅資源豐富，且富含萜類、生物堿、黃酮類物質等多種生物活性成分，具有顯著的抗炎、止咳、抑菌、保肝療效，安全方便，是一種良好的中草藥資源［2-4］。

隨著我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，畜禽致病菌多重感染、抗生素長期大量使用帶來的畜禽產品安全問題日益突出，如腸道菌群失衡、毒副作用、耐藥性及其傳遞轉移等負效應。因此，探索與研制抗菌活性高、毒性低、殘留少的廣譜飼料抗生素替代品，以提高細菌多重感染性疾病的控制水平和畜禽產品的質量安全已成為21世紀健康養(yǎng)殖的重要課題。

研究證明，揮發(fā)油(essentia1oi1)的活性成分具有較強的表面活性和脂溶性，能迅速穿透病原微生物的細胞膜，使其內容物流失，并能有效阻止線粒體內的呼吸氧化過程，使病原微生物喪失能量供應而死亡［5］。目前，揮發(fā)油也已作為飼料添加劑被應用于畜牧生產中，圍繞各種揮發(fā)油進行的試驗也成為了當前飼料添加劑研究的熱點之一［6-7］，但有關蟛蜞菊揮發(fā)油作為抗生素替代品應用于飼料中的研究較少。本研究以4種病原菌為對象，研究了蟛蜞菊揮發(fā)油的抑菌效果，為其作為飼料抗生素替代品的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與設備

1.1.1 植物原材料 蟛蜞菊地上部分采自福建農林大學。

1.1.2 供試菌種 大腸桿菌（Escherichia coli）；金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）；葡萄球菌（Staphylococcus sp.）；沙門氏菌（Salmonella sp.）購于中國藥品生物制品檢定所。

1.1.3 主要試驗設備和藥品 揮發(fā)油水蒸汽提取裝置，正茂玻璃儀器廠；LRH-150生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（潔凈度100級），蘇州凈化設備有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-16G臺式高速冷凍離心機，上海安亭科技儀器廠；JEM—1010型透射電電子顯微鏡，日本電子株式會社。乙醚、95%乙醇、氯化鈉、硫酸鈉等均為分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基配制 肉湯培養(yǎng)基：肉湯培養(yǎng)基1.1 g，50 mL蒸餾水，121℃滅菌30 min備用；瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂培養(yǎng)基4.5 g，100 mL蒸餾水，121℃滅菌30 min備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 蟛蜞菊揮發(fā)油的提取 準確稱取2 000.0 g新鮮蟛蜞菊地上部分，切成1～2 cm碎片，置于揮發(fā)油水蒸汽提取裝置中，按水蒸汽蒸餾法進行蒸餾4 h，收集揮發(fā)油，經(jīng)NaC1飽和后用乙醚萃取3次，萃取液用無水硫酸鈉干燥，過夜，蒸餾回收乙醚后冷藏備用。

1.2.2 抑菌活性的測定

1)抑菌原液樣品制備。取蟛蜞菊揮發(fā)油，用95%乙醇溶解稀釋成含揮發(fā)油50 mg/mL的藥液，濾菌備用。

2)抑菌圈測定（濾紙片擴散法）。將直徑為6 mm的圓濾紙片經(jīng)高壓滅菌后在50 mg/mL的揮發(fā)油藥液中浸漬10 min備用。將濃度為105CFU/mL的各試驗菌懸液0.2 mL在相應的固體培養(yǎng)基上均勻涂布，制成含菌平板。取浸漬過的濾紙片貼于不同的含菌平皿上，用稀釋10-4倍的慶大霉素作陽性對照，用95%乙醇作陰性對照，將各培養(yǎng)皿置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后。精確量取抑菌圈直徑，結果取4次重復試驗的平均值。

3)最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌溶度（MBC）測定。將蟛蜞菊揮發(fā)油加到2 mL 1.0×105CFU/mL各試驗菌懸液中，使揮發(fā)油最終稀釋濃度為70、60、50、40、30 mg/mL，同時設細菌對照組和空白對照組，置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察結果，以無菌生長的最低濃作為該供試菌種的最小抑菌濃度。

從MIC試驗無菌生長的試管中吸取0.05 mL液體加入到0.15 mL肉湯培養(yǎng)基中混和均勻（通過稀釋法解除殘留藥物的抑菌作用），吸取0.1 mL到固體培養(yǎng)基中涂布均勻。將培養(yǎng)皿正面向上放入37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約0.5 h后，待表面干燥將培養(yǎng)皿倒扣繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，以完全無菌生長的最低濃度作為該供試菌種的最低殺菌濃度。

2 結果與分析

由表1可知，蟛蜞菊揮發(fā)油對4種供試細菌都有較好的抑制作用，表現(xiàn)出良好的廣譜抗菌效果，其中以對大腸桿菌的抑制作用最強。結果顯示，蟛蜞菊揮發(fā)油對沙門氏菌的最小抑菌濃度為40 mg/mL，其他的則為50 mg/mL。根據(jù)文獻（劉洋等，2009），蟛蜞菊揮發(fā)油對供試菌種的MIC都介于7.81～250 g/L，為中度敏感。

表1 蟛蜞菊揮發(fā)油對7種供試菌的抑菌圈和MIC、MBC

3 討論

蟛蜞菊揮發(fā)油對常見的畜禽病原菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、葡萄球菌和沙門氏菌都具有良好的抑制效果，顯示出廣譜的抗菌效果。雖然與抗生素相比，蟛蜞菊揮發(fā)油的抑菌效果較差，但是抗生素在畜牧養(yǎng)殖生產中濫用造成的藥物殘留不僅嚴重影響畜產品的質量，且導致多重耐藥與交叉耐藥性，更嚴重威脅著人類的健康。而植物本身所具有的低毒、低殘留、低耐藥性等特性是抗生素所不具備的。因此，研究開發(fā)蟛蜞菊揮發(fā)油作為飼料添加劑具有一定的生產意義，但是其具體抗菌成分和抗菌機制尚未明確，需要進一步深入研究。

［1］江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典(下冊)［M］.上海:上海科技出版社，2002:2701.

［2］宋立人，洪恂，丁緒亮，等.現(xiàn)代中藥學大辭典(上冊)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:2456-2457.

［3］ 謝宗萬.漢拉英對照中藥材正名詞典［M］.北京:北京科學技術出版社，2004:766.

［4］ 梁方方，莫毅，賴志強，等.蟛蜞菊對小白鼠的急性毒性試驗［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(3):223-225.

［5］ 姚新生.天然藥物化學［M］.3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:245-246.

［6］ Hayashi K，Imanishi N，Kashiwayama Y.Inhibitory effect of cinnama1dehyde，derived from Cinnamomi cortex，on the growth of inf1uenza A/PR/8 virus in vitro and in vivo［J］.Antivira1Research，2007，74:1-8.

［7］ Chung-Jen Chen，Martin Michae1is，Hseng-Kuang Hsu.Toona sinensis Roem tender 1eaf Extract inhibits SARS coronavirus rep1ication［J］.Journa1of Ethnopharmaco1ogy，2008，120:108-111.