趙憲林，李耀坤，田萬(wàn)強(qiáng)，胡建宏，昝林森＊，王韋華

在給動(dòng)物授精之前對(duì)精子進(jìn)行有目的的選擇，即將X和Y精子分離，是實(shí)現(xiàn)性別控制最理想的途徑［1］。人們對(duì)性控精液在奶牛生產(chǎn)中的應(yīng)用期盼已久，近年來(lái)熒光活性細(xì)胞的分類將該技術(shù)帶到了商業(yè)應(yīng)用的邊緣。利用冷凍的性控精液和XY精子的分選技術(shù)將增強(qiáng)生產(chǎn)者獲得廉價(jià)后備母牛的能力，加快牛群擴(kuò)繁進(jìn)度提高繁殖效益［2］，但該技術(shù)依然受到分選速度低、成本價(jià)格高及授精率低三種限制因素的制約［3，4］。研究提高性控精液品質(zhì)、授精率及降低生產(chǎn)成本顯得非常重要。

從20世紀(jì)50～90年代，有許多人用物理法和免疫法進(jìn)行分離X精子與Y精子的試驗(yàn)研究，雖然都曾有成功的報(bào)道，但是通過熒光原位雜交技術(shù)（FISH）和流式細(xì)胞儀測(cè)定技術(shù)，對(duì)上述方法分離后的精子進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是物理學(xué)方法還是免疫學(xué)方法都缺乏可靠性和可重復(fù)性。直到20世紀(jì)80～90年代，以X和Y精子DNA含量存在差異為原理，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分離X和Y精子技術(shù)才取得突破性進(jìn)展，目前經(jīng)分離的X和Y精子已經(jīng)在畜牧生產(chǎn)上得到了應(yīng)用。但是由于生產(chǎn)技術(shù)復(fù)雜及高成本因素及受胎率低的影響，使得性控精液推廣難度很大，使得這一技術(shù)不能很好的服務(wù)于廣大奶農(nóng)。所以，研究提高性控精液品質(zhì)、降低性控精液生產(chǎn)成本、加大精液分離速度成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。

本研究以西北農(nóng)林科技大學(xué)和大慶田豐生物工程有限公司為試驗(yàn)基地，通過對(duì)其性控凍精稀釋液配方、精子分離設(shè)備的改進(jìn)，達(dá)到提高性控凍精品質(zhì)、降低性控凍精生產(chǎn)成本的目的，為性控凍精的高受胎率低價(jià)格提供必要的理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)儀器與試劑

主要儀器：流式細(xì)胞儀，電熱恒溫培養(yǎng)箱（HHB11·500型），電子分析天平（JA1003型），細(xì)管一體機(jī)（法國(guó)，DIGITCOOL－5300型），比色密度測(cè)定儀（法國(guó)，RS－232型），自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠，SZ－93型），無(wú)菌操作臺(tái)顯微鏡。

2 試驗(yàn)地點(diǎn)與方法

2.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

本研究在西北農(nóng)林科技大學(xué)和大慶田豐生物工程有限公司開展。

2.2 精液采集

選擇年齡2～5歲，體質(zhì)健壯、繁殖性能良好的3頭荷斯坦種公牛。利用假陰道法在每周二、五早上9點(diǎn)鐘采精。鮮精經(jīng)過常規(guī)檢測(cè)分析，活力大于0.60，密度為1.5×109mL－1以上的正常精液用于本次試驗(yàn)。

2.3 精子處理

1）精子分離環(huán)境：十萬(wàn)級(jí)空氣過濾，20℃室溫。

2）分離前處理：根據(jù)原精濃度取4億精子進(jìn)行染色處理。取14uL H33342熒光染色液放入5mL專用試管，加入2mL TALP液與4億精子混合。

3）試驗(yàn)中精子染色溫度為34℃，避光孵育30min，然后加入2mL 4%卵黃TALP液。

4）分離機(jī)啟動(dòng)調(diào)試及處理并啟動(dòng)分離系統(tǒng)。

5）每管樣品分離1～1.5h，分取精子1 500～2000萬(wàn)，然后換管。

6）分離精液的冷凍：①分離精液平衡；②分離后的精液在20℃條件下1 800轉(zhuǎn)／min離心5min；③除上清液加冷凍精液保護(hù)液；④分離精液裝管打印標(biāo)記并冷凍上架。

2.4 精子質(zhì)量檢測(cè)

2.4.1 精子活率的檢測(cè) 本次試驗(yàn)精子活率由肉眼觀察進(jìn)行測(cè)定［5］。

2.4.2 精子頂體完整率的檢測(cè)［5］細(xì)管凍精解凍后，將細(xì)管中間的一滴精液滴于載玻片的左端，用另一張邊緣光滑的載玻片呈35°角自右面接觸液滴，拉向另一側(cè)，制成抹片。自然風(fēng)干5～10min后，用福爾馬林磷酸鹽固定液固定15min，水洗干燥后，用姬姆薩染色90min，自來(lái)水沖洗，干燥，顯微鏡下觀察300個(gè)精子，統(tǒng)計(jì)頂體完整的精子數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。

3 生產(chǎn)工藝改進(jìn)及效果分析

3.1 精子分離設(shè)備激光系統(tǒng)的改進(jìn)及效果

經(jīng)過數(shù)位專家的論證及課題組研究生多次實(shí)驗(yàn)探索，首先從儀器著手，對(duì)精子分離設(shè)備的激光系統(tǒng)進(jìn)行改造，把原亞離子紫外激光換為固態(tài)鎖模紫外激光。其次，為進(jìn)一步提升設(shè)備的分離速度，實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)降耗，在項(xiàng)目組專家的指導(dǎo)下，企業(yè)更換了原有的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，配備了經(jīng)過升級(jí)的X、Y精子分離軟件系統(tǒng)，使設(shè)備的分離速度得到了進(jìn)一步提高。

3.1.1 精子分離速度提高情況 通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，更換后精子的分離速度從原來(lái)的3 400個(gè)／s提高到5 400個(gè)／s，分離速度提高58%以上。更換激光系統(tǒng)后，精子分離速度得到大幅提升。究其原因，數(shù)位專家一致認(rèn)為可能是原亞離子紫外激光換為固態(tài)鎖模紫外激光并升級(jí)X、Y精子分離軟件系統(tǒng)后，提高了激光的穩(wěn)定性，增強(qiáng)了設(shè)備對(duì)X、Y精子的分辨力，從而增加了精子分離速度。

3.1.2 每支細(xì)管有效精子數(shù)提高與生產(chǎn)成本降低情況 在本次試驗(yàn)中把原亞離子紫外激光換為固態(tài)鎖模紫外激光后，分離速度達(dá)到5 400個(gè)／秒，比原來(lái)分離速度提高58%以上，大大提高了性控精液的生產(chǎn)效率。并大幅降低了生產(chǎn)成本。精子分離速度增加，一方面每支細(xì)管有效精子數(shù)達(dá)210萬(wàn)以上，比改進(jìn)前的170萬(wàn)提高了近40萬(wàn)有效精子數(shù)；另一面，分離速度的提高造成生產(chǎn)效率提高，為此顯著節(jié)約了生產(chǎn)成本。生產(chǎn)工藝改進(jìn)之前，每支性控精液成本價(jià)為81元，工藝改進(jìn)后，生產(chǎn)效率提高58%以上。可以看出精子活率提高6.17%，授精率提高7.25%，相當(dāng)于提高了種公牛7.25%的利用率，則每支性控精液成本則降低至40元以下。

3.2 性控凍精保護(hù)液配方改進(jìn)及效果

經(jīng)多方調(diào)查研究認(rèn)為原精子保護(hù)液在精子冷凍過程中不能起到積極的保護(hù)作用，導(dǎo)致冷凍解凍后精子品質(zhì)較差。經(jīng)過多位專家討論、課題組老師及學(xué)生反復(fù)試驗(yàn)，最后對(duì)精子保護(hù)液配方進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后性控凍精解凍后精子品質(zhì)得到了顯著提高，同時(shí)對(duì)精液中抗氧化物酶的活性起到了積極的保護(hù)作用。原保護(hù)液配方及改進(jìn)型保護(hù)液配方及效果如下：原精子保護(hù)液配方：2.9%檸檬酸鈉、12%蔗糖液，卵黃20%，甘油6%。慶大霉素1.3mL，林肯霉素0.3mL。改進(jìn)型保護(hù)液配方：海帶多糖0.2%、葡萄糖2%、檸檬酸鈉1.0%、蒸餾水70%、白蛋白15%、甘油8%、青霉素9萬(wàn)IU。

3.2.1 工藝改進(jìn)前后精子活率和頂體完整率對(duì)比性控精液生產(chǎn)工藝改進(jìn)前后對(duì)精子的常規(guī)品質(zhì)見表1。由表1可以看出，工藝改進(jìn)后，精子活率提高11.30%，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；頂體完整率提高11.06%，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。精液在冷凍過程中精子死亡率高，活率低［6－8］。造成性控精液精子活率低的原因可能是精子經(jīng)過復(fù)雜的程序處理，在進(jìn)入冷凍程序之前處理時(shí)間太長(zhǎng)，精子能量消耗較大，活力減弱。分離后活力弱的精子可能會(huì)在冷凍解凍過程中大量死亡，有效精子數(shù)減少，活率降低。頂體完整率和精子的受精率相關(guān)，頂體受損，導(dǎo)致頂體酶流失，使精子失去受精能力。但是本試驗(yàn)表明，生產(chǎn)工藝改進(jìn)后，精子活率頂體完整率和授精率得到較大提高。分析其原因，可能是保護(hù)液在精子處理過程中起到了較大的保護(hù)作用。

表1 工藝改進(jìn)前后性控精液中精子活率和頂體完整率比較

3.2.2 工藝改進(jìn)前后精液中抗氧化物酶活力對(duì)比性控精液生產(chǎn)工藝改進(jìn)前后，精液抗氧化物酶水平變化見表2。由表2我們可以看出工藝改進(jìn)后，過氧化氫酶活性顯著提高，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著提高，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶活性有所提高但沒有達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。

表2 工藝改進(jìn)前后性控精液中抗氧化物酶活力比較

精液中的抗氧化物酶具有清除精液中活性氧促離子自由基，在精子存活及授精過程中有重要的保護(hù)作用［9，10］。在本次試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶顯著提高，谷胱甘肽過氧化物酶顯著提高，差異都達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）；超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶雖然沒有達(dá)到顯著水平（P＞0.05），但是酶活力依然比工藝改進(jìn)前略高。原因可能是過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性較強(qiáng)，并在精液處理過程中得到了精子保護(hù)液中某種物質(zhì)的保護(hù)；超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶沒有得到顯著提高，可能是酶活力本身活性較差，并且在精液處理過程中沒有得到有效保護(hù)。

3.2.3 工藝改進(jìn)后體外授精率及犢牛性別控制準(zhǔn)確率分析 性控精液生產(chǎn)工藝改進(jìn)前后，體外授精率及犢牛性別控制準(zhǔn)確率見表3。

表3 工藝改進(jìn)后體外授精率及犢牛性別控制準(zhǔn)確率比較

在性控凍精工藝改進(jìn)前，由于每支細(xì)管中有效精子數(shù)較低且品質(zhì)較差，故授精率較低。改進(jìn)后性控凍精生產(chǎn)工藝不但加大了對(duì)精子的保護(hù)力度，并提高了犢牛性別控制準(zhǔn)確率。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中受胎率達(dá)到82%，比工藝改進(jìn)前提高7.9%；犢牛性別控制準(zhǔn)確率達(dá)到了95.2%，比工藝改進(jìn)前提高3.5%。

綜上所述，性控精液生產(chǎn)工藝改進(jìn)后，顯著提高了精子活率、頂體完整率、母牛受胎率、犢牛性別控制準(zhǔn)確率，并且提高了精液中抗氧化物酶活性，加快了分離速度，提高了每支細(xì)管有效精子含量，同時(shí)大幅降低了生產(chǎn)成本。使生產(chǎn)成本降至40元以下。

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