龐 慧，李 瑩，李密密，嚴(yán)琴琴，杭悅宇，孫小芹

〔江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)江蘇省植物遷地保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014〕

FAE1基因是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的調(diào)控芥酸等超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的關(guān)鍵基因［1］，該基因主要通過(guò)編碼β－酮酯酰 CoA 合酶(KCS)控制芥酸合成［1－2］，同時(shí)也在蠟質(zhì)及鞘脂類(lèi)等超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成中起重要作用［3］。FAE1基因最初克隆自擬南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Hey.〕［4］，其后主要克隆自十字花科(Brassicaceae)植物，如從甘藍(lán)型油菜(Brassica napus Linn.)、白菜型油菜(B.campestris Linn.)、芥菜型油菜(B.juncea Linn.)、黑芥(B.nigra Linn.)、白芥(Sinapis alba Linn.)和中歐芥〔Teesdalia nudicaulis(Linn.)R.Br.〕等種類(lèi)中均獲得 FAE1 基因［5－10］。雖然不同種類(lèi)的FAE1基因在長(zhǎng)度與序列上存在差異，但均無(wú)內(nèi)含子。目前，F(xiàn)AE1基因的克隆方法主要有轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法、探針?lè)癊coTILLING法(ecotype targeting induced local lesions in genomes)等［4，7，11］，其中最常見(jiàn)的方法為同源序列擴(kuò)增法［8，10］。

FAE1基因的功能驗(yàn)證主要包括酵母與植物轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，這些研究大多也在十字花科植物中進(jìn)行。酵母中脂肪酸延長(zhǎng)酶活性很低，只能合成微量的超長(zhǎng)鏈脂肪酸，是研究 FAE1編碼蛋白活性的常用體系［12－13］。Millar等［14］將擬南芥的 FAE1 基因轉(zhuǎn)化到酵母中，發(fā)現(xiàn)隨著FAE1基因的表達(dá)長(zhǎng)鏈脂肪酸在酵母中累積;而將諸葛菜〔Orychophragmus violaceus(Linn.)O.E.Schulz〕和薺〔Capsella bursa-pastoris(Linn.)Medikus〕2種零芥酸種類(lèi)的 FAE1基因轉(zhuǎn)化到酵母中，雖然都能表達(dá)出預(yù)期的蛋白產(chǎn)物，但卻無(wú)長(zhǎng)鏈脂肪酸的累積［9，15］;中歐芥及海甘藍(lán)(Crambe abyssinica Hochst.ex R.E.Fr.)的栽培品種‘Prophet’的FAE1基因功能除了在酵母中得到驗(yàn)證，還被轉(zhuǎn)化至擬南芥中，同樣發(fā)現(xiàn)該基因能顯著促進(jìn)長(zhǎng)鏈脂肪酸的累積［16－17］。此外，將擬南芥的FAE1基因轉(zhuǎn)化到煙草(Nicotiana tabacum Linn.)中，隨 FAE1基因的表達(dá)長(zhǎng)鏈脂肪酸在煙草中累積;在擬南芥中過(guò)量表達(dá)FAE1基因，其長(zhǎng)鏈脂肪酸含量也明顯提高［14］。由此可見(jiàn)，雖然十字花科種類(lèi)很多，但FAE1基因的克隆與功能驗(yàn)證研究主要集中于蕓薹屬(Brassica Linn.)植物及擬南芥，而在其他十字花科植物中FAE1基因的特性尚未見(jiàn)研究報(bào)道。

鑒于此，作者對(duì)十字花科8屬9種1亞種的FAE1基因進(jìn)行了克隆、比對(duì)及功能驗(yàn)證，以期對(duì)十字花科植物中FAE1基因存在的普遍性及功能的相似性進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的十字花科8屬9種1亞種包括蕓薹屬的非洲芥菜(B.tournefortii Gouan，原產(chǎn)地印度)、埃塞俄比亞芥(B.carinata A.Braun，原產(chǎn)地加拿大)和短喙芥(B.elongata Ehrhart，原產(chǎn)地伊朗);芝麻菜屬(Eruca Miller)的芝麻菜〔E.vesicaria subsp.sativa(Miller)Thellung，原產(chǎn)地波蘭〕;蘿卜屬(Raphanus Linn.)的野蘿卜(R.raphanistrum Linn.，原產(chǎn)地印度);兩節(jié)薺屬(Crambe Linn.)的 C.filiformis Jacq.(原產(chǎn)地加拿大);菥蓂屬(Thlaspi Linn.)的菥蓂(T.arvense Linn.原產(chǎn)地波蘭);臭薺屬(Coronopus Zinn)的臭薺〔C.didymus(Linn.)Smith，原產(chǎn)地中國(guó)江蘇〕;薺屬(Capsella Medikus)的薺〔C.bursa-pastoris(Linn.)Medikus，原產(chǎn)地中國(guó)江蘇〕;碎米薺屬(Cardamine Linn.)的小花碎米薺(C.parviflora Linn.，原產(chǎn)地中國(guó)江蘇)。其中，非洲芥菜、埃塞俄比亞芥和C.filiformis種子由加拿大植物種質(zhì)資源庫(kù)(Plant Gene Resources of Canada，PGRC)提供，短喙芥、芝麻菜、野蘿卜和菥蓂種子由美國(guó)種質(zhì)資源庫(kù)(Germplasm Resources Information Network，GRIN)提供;臭薺、薺和小花碎米薺種子均采自南京中山植物園。種子萌發(fā)后栽培于本所種質(zhì)圃，幼苗長(zhǎng)出后采集新鮮幼嫩葉片備用。

1.2 方法

1.2.1 FAE1基因的克隆與序列分析 按改良的CTAB法［18］從葉片中提取基因組DNA。在引物TF/TR［16］兩側(cè)分別加上 KpnI與 BamHI酶切位點(diǎn)，合成TFK引物(序列為5'－CGGGGTACCGCAATGACGTCC GTTAAC－3')和 TRB 引物(序列為 5'－CGCGGATCC GGACCGACCGTTTTGGAC－3')。使用TFK和TRB引物對(duì)各種類(lèi)的FAE1基因進(jìn)行擴(kuò)增。

用PE－9700型PCR儀(Perkin Elmer公司生產(chǎn))進(jìn)行PCR 反應(yīng)。擴(kuò)增體系總體積20 μL，包含2.0 μL 10×PCR buffer、0.2 mmol·L－1dNTPs、2.0 mmol·L－1Mg2+、0.2 μmol·L－1引物、0.4 U Taq DNA 聚合酶和20 ng模板DNA，以滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，53℃退火40 s，72℃ 延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);最后于72℃保溫7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 0.8%的瓊脂糖凝膠(含 0.5 μg·mL－11×EB)電泳約1 h，用WV－BP330凝膠掃描分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))進(jìn)行觀察和拍照。按AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒方法將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行割膠純化，按pMD19－T載體試劑盒方法將純化產(chǎn)物連接到pMD19－T載體〔購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司〕上，通過(guò)PCR篩選的陽(yáng)性克隆交上海華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。

用Sequencher軟件對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行編輯和拼接，采用Clustal W軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，用MEGA5.1軟件對(duì)DNA和蛋白質(zhì)序列的同源性進(jìn)行比較。

1.2.2 FAE1基因的酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)分析 酵母轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［12］進(jìn)行。用BamHI/KpnI雙酶切pMD19－T重組載體，將目的片段連接到酵母表達(dá)載體pYES2/NT C(Invitrogen出品)上，位于載體半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子的下游，通過(guò)表達(dá)產(chǎn)生N末端融合了(His)6Gly標(biāo)簽的融合蛋白;以空載體pYES2/NT C作為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)化到酵母菌株InvSc1中，并在含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2%葡萄糖但不含尿嘧啶的培養(yǎng)基上(SC－ura)進(jìn)行暗培養(yǎng)并篩選。轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞接種到含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2%葡萄糖的SC－ura液體培養(yǎng)基中，于28℃條件下振蕩暗培養(yǎng)過(guò)夜;用含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2%半乳糖的SC－ura液體培養(yǎng)基將其稀釋到OD600=0.02，并繼續(xù)振蕩暗培養(yǎng)至 OD600=1.4;將酵母培養(yǎng)物分為等量的2份，分別用于Western blot分析及氣相色譜分析。

1.2.3 Western blot分析 用酵母蛋白提取試劑盒(南京凱基公司，Cat No.KGP650)提取酵母細(xì)胞總蛋白，然后用HisBind resin純化蛋白。參照文獻(xiàn)［12］進(jìn)行Western blot分析，采用10%SDS－PAGE凝膠電泳，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為PageRuler Prestained Protein Ladder(Fermentas公司出品)。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上進(jìn)行Western blot分析，然后用一抗HisG抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG檢測(cè)，最后顯色。

1.2.4 氣相色譜分析 酵母細(xì)胞的脂肪酸分析參照文獻(xiàn)［12］進(jìn)行。酵母細(xì)胞用超純水洗滌2次;然后用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)10%KOH－體積分?jǐn)?shù)95%甲醇的混合溶液于80℃皂化反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后置于冰上冷凍，再用正己烷洗滌以去除未皂化物;剩余水相用6 mol·L－1HCl酸化。用正己烷萃取游離脂肪酸，減壓濃縮以去除多余溶劑;游離脂肪酸用含1%H2SO4的甲醇溶液2 mL于60℃條件下甲基化1 h;然后用正己烷萃取脂肪酸甲酯，減壓去除溶劑，剩余物用于氣相色譜分析，脂肪酸含量采用峰面積歸一法計(jì)算。

2 結(jié)果和分析

2.1 FAE1基因的克隆和序列分析

用引物TFK/TRB對(duì)供試的9種1變種的FAE1基因進(jìn)行擴(kuò)增，均得到Rf值相等的單一條帶，其中，芝麻菜、Crambe filiformis、野蘿卜、菥蓂、非洲芥菜、埃塞俄比亞芥和短喙芥的FAE1序列長(zhǎng)度均為1 521 bp，臭薺的FAE1序列長(zhǎng)度為1 517 bp，薺和小花碎米薺的FAE1序列長(zhǎng)度為1 518 bp。所有種類(lèi)的FAE1基因序列已在GenBank上登錄，非洲芥菜、埃塞俄比亞芥、短喙芥、芝麻菜、野蘿卜、Crambe filiformis、菥蓂、臭薺、薺和小花碎米薺的登錄號(hào)分別為JX898749、JX898750、JX898751、JX898752、JX898753、JX898754、JX898755、JX898756、JX898757 和 JX898758。

供試的9種1亞種的FAE1序列相似性較高，相似度達(dá)89%。比對(duì)分析結(jié)果表明:對(duì)位排列矩陣長(zhǎng)度為1 521 bp，其中，保守位點(diǎn)1 051個(gè)，占序列總長(zhǎng)度的69.1%;變異位點(diǎn)470個(gè)，占總長(zhǎng)度的30.9%;簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)232個(gè)，占總長(zhǎng)度的15.3%。臭薺、薺和小花碎米薺的FAE1序列在第132位均缺失3個(gè)堿基，臭薺的FAE1序列在第515位缺失1個(gè)堿基。

基于擬南芥的FAE1序列(GenBank登錄號(hào)NM_119617.2)，將供試種類(lèi)的FAE1基因序列翻譯成氨基酸序列，獲得的氨基酸序列長(zhǎng)度存在差異，但絕大部分編碼完整。芝麻菜、Crambe filiformis、野蘿卜、菥蓂、非洲芥菜、埃塞俄比亞芥和短喙芥的FAE1基因編碼506個(gè)氨基酸，薺與小花碎米薺的編碼505個(gè)氨基酸;而臭薺由于在515 bp處缺失1個(gè)堿基，導(dǎo)致其FAE1基因編碼的氨基酸序列提前終止，僅編碼186個(gè)氨基酸。比對(duì)分析結(jié)果顯示:供試9種1亞種的FAE1基因編碼的氨基酸序列也高度相似，相似度達(dá)88.9%;各種類(lèi)的氨基酸序列間存在151個(gè)變異位點(diǎn)，其中有6個(gè)位點(diǎn)與種子芥酸相對(duì)含量有關(guān)(表1)。

2.2 FAE1基因功能的驗(yàn)證

2.2.1 Western blot分析結(jié)果 將供試9種1亞種的FAE1基因所構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至酵母中，經(jīng)Western blot分析，發(fā)現(xiàn)它們的FAE1基因在酵母中均表達(dá)出預(yù)期的蛋白產(chǎn)物，且編碼蛋白的分子量相似，相對(duì)分子質(zhì)量均為60 000左右。其中臭薺的FAE1基因由于移碼突變只編碼包含186個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，但實(shí)際上轉(zhuǎn)化至酵母中仍可表達(dá)出分子量正常的蛋白產(chǎn)物;而從含有pYES2/NT C空載體的酵母菌株(對(duì)照)中則未檢測(cè)出目標(biāo)蛋白(圖1)。

表1 十字花科植物FAE1基因編碼的氨基酸序列變異位點(diǎn)與其種子芥酸相對(duì)含量的對(duì)應(yīng)分析Table 1 Corresponding analysis of variable site of amino acid sequence encoded by FAE1 gene from Brassicaceae species to relative content of erucic acid in seed

圖1 十字花科植物FAE1基因的轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析結(jié)果Fig.1 Analysis result of Western blot of expression product in transformed yeast cell of FAE1 gene from Brassicaceae species

2.2.2 氣相色譜分析結(jié)果 用氣相色譜法分析各種類(lèi)FAE1基因轉(zhuǎn)化酵母中的芥酸含量，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn):在作為對(duì)照的含pYES2/NT C空載體的酵母細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)出芥酸，而在非洲芥菜、埃塞俄比亞芥、短喙芥、菥蓂、芝麻菜、野蘿卜、C.filiformis和薺FAE1基因的轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中均有芥酸積累，其中在薺FAE1基因的轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中芥酸相對(duì)含量最高，達(dá)4.63%;而在臭薺和小花碎米薺FAE1基因的轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中芥酸相對(duì)含量均為0.00%。

表2 十字花科植物FAE1基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中芥酸相對(duì)含量的比較Table 2 Comparison of relative content of erucic acid in transformed yeast cell of FAE1 gene from Brassicaceae species

3 討論和結(jié)論

3.1 FAE1基因編碼的氨基酸序列與轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中芥酸含量的關(guān)系

前人對(duì)擬南芥及油菜突變體的研究結(jié)果［19］顯示:在FAE1基因編碼的氨基酸序列中有11個(gè)位點(diǎn)的任何一個(gè)發(fā)生突變，會(huì)導(dǎo)致高芥酸種類(lèi)(通常種子中芥酸含量大于30%的為高芥酸種類(lèi)，芥酸含量小于10%的為低芥酸種類(lèi)［12］)的FAE1基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中芥酸含量為0，這11個(gè)位點(diǎn)是6個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)(Cys84、Cys223、Cys270、Cys312、Cys389 和 Cys460)、4個(gè)組氨酸位點(diǎn)(His302、His387、His391和 His420)及絲氨酸/苯丙氨酸位點(diǎn)(Ser/Phe282)。但武玉花等［9］的研究結(jié)果顯示:這11個(gè)位點(diǎn)未發(fā)生任何變異，推測(cè)其他氨基酸位點(diǎn)的變異也與FAE1基因轉(zhuǎn)化酵母的芥酸含量相關(guān)。本研究結(jié)果與武玉花等的結(jié)果基本一致，在本研究涉及的高、低芥酸種類(lèi)中這11個(gè)位點(diǎn)也并未有任何變異，說(shuō)明這11個(gè)位點(diǎn)的進(jìn)化十分保守。而前人有關(guān)脂肪酸延長(zhǎng)酶活性位點(diǎn)的研究是在遺傳背景一致的材料間(如同種的不同品種間)進(jìn)行的，因而在不同的物種間這些變異并不穩(wěn)定。在本研究中，由FAE1編碼的氨基酸序列的151個(gè)變異位點(diǎn)中有6個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)與轉(zhuǎn)化酵母的芥酸含量相關(guān)，如第14位氨基酸殘基在轉(zhuǎn)化酵母有芥酸積累的埃塞俄比亞芥等7種植物中為異亮氨酸，而在轉(zhuǎn)化酵母無(wú)芥酸積累的臭薺和小花碎米薺中為亮氨酸，同樣的情形還可見(jiàn)于第22位的苯丙氨酸/亮氨酸、第56位的異亮氨酸/纈氨酸、第106位的纈氨酸/異亮氨酸、第122位的色氨酸/絲氨酸、第286位的精氨酸/甘氨酸，因此，這6個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變異可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)化酵母無(wú)芥酸積累的原因之一，當(dāng)然，這一結(jié)論還有待于采用定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

從序列上看，由于移碼突變，臭薺的FAE1基因只編碼186個(gè)氨基酸，但在轉(zhuǎn)化酵母中仍可表達(dá)出分子量正常的蛋白產(chǎn)物，這也許是由于基因本身的終止密碼子比突變出現(xiàn)的終止密碼子更有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，因而使基因仍可通讀;但其轉(zhuǎn)化酵母中的芥酸相對(duì)含量為0.00%，表明該編碼蛋白并無(wú)酶活性，在酵母細(xì)胞中不能催化長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成。

3.2 FAE1基因轉(zhuǎn)化酵母的芥酸含量與其種子芥酸含量的關(guān)系

前人的研究結(jié)果表明:十字花科植物的種子芥酸含量高，其FAE1基因轉(zhuǎn)化至酵母中也使酵母細(xì)胞中的芥酸含量相應(yīng)提高，反之亦然;如高芥酸植物油菜(Brassica napus Linn.)、甘藍(lán)(B.oleracea Linn.)和蕪青(B.rapa Linn.)的一些栽培品種，其FAE1基因轉(zhuǎn)化酵母中芥酸含量可達(dá)1.94% ～2.19%;而低芥酸栽培植物B.napus‘Westar’的FAE1基因轉(zhuǎn)化酵母中芥酸含量為0%［12－13］;同樣的情形也存在于高芥酸甘藍(lán)型油菜‘中油821’、新疆白芥、新疆野芥(Sinapis arvensis Linn.)、菘藍(lán)(Isatis indigotica Fort.)及低芥酸植物諸葛菜和薺中［9］。

本課題組前期對(duì)十字花科94種野生植物種子芥酸含量的分析結(jié)果表明［15］:非洲芥菜等6種1亞種的種子芥酸含量均高于30%，為高芥酸種類(lèi);臭薺與小花碎米薺種子芥酸含量為0.00% ～1.30%，為低芥酸種類(lèi)。本研究結(jié)果顯示:在非洲芥菜等6種1亞種FAE1基因的轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中芥酸相對(duì)含量為0.27%～2.50%，而在臭薺和小花碎米薺FAE1基因的轉(zhuǎn)化酵母中芥酸相對(duì)含量為0.00%，證實(shí)了前期的研究結(jié)果;同時(shí)，除薺外的8種1亞種的種子芥酸相對(duì)含量與轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中的芥酸含量呈正相關(guān)(r=0.493)，更明確了植物種子芥酸含量與該物種FAE1基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中芥酸含量的正相關(guān)關(guān)系。

3.3 薺的FAE1基因克隆與功能驗(yàn)證

前期的測(cè)定結(jié)果顯示薺的種子中芥酸相對(duì)含量為0.61%，為低芥酸種類(lèi)［15］，其 FAE1基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中芥酸相對(duì)含量卻遠(yuǎn)高于其他高芥酸種類(lèi)，表明其編碼的脂肪酸延長(zhǎng)酶具有很高活性，這種特例之前未見(jiàn)報(bào)道。推測(cè)其原因可能是在薺體內(nèi)受到各式元件調(diào)控而導(dǎo)致FAE1基因功能不正常，但在酵母表達(dá)系統(tǒng)中其基因編碼區(qū)脫離了各式調(diào)控元件的作用，從而恢復(fù)正常功能;也可能是由于FAE1基因在植物體內(nèi)可能受到包括甲基化在內(nèi)的基因修飾和調(diào)節(jié)作用，關(guān)閉了該基因的活性，而在酵母中去甲基化后基因又重新活化表達(dá)［20］。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中薺的FAE1基因擴(kuò)增十分困難［9］，作者也是嘗試多次后才獲得成功，這一現(xiàn)象也可能是該基因發(fā)生甲基化作用的佐證。

致謝:美國(guó)種質(zhì)資源庫(kù)與加拿大植物種質(zhì)資源庫(kù)饋贈(zèng)部分種類(lèi)的種子，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所盧長(zhǎng)明研究員與武玉花助理研究員饋贈(zèng)酵母菌株與質(zhì)粒，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所高建芹副研究員完成脂肪酸的氣相色譜分析，在此一并致謝!

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