李慧敏，劉艷妮，王小蕊，康杰芳

(陜西師范大學(xué)教育部藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062)

山茱萸(Cornus officinalis Sieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉是三大名貴木本藥材之一［1］。新鮮山茱萸果肉中含有單糖、多糖、有機(jī)酸、苷類、環(huán)烯醚萜類、黃酮、蒽醌、甾體和內(nèi)酯等成分［2］，臨床上多用山萸肉和酒山萸肉;山茱萸是常用的降血糖藥物［3］，常出現(xiàn)在中醫(yī)降血糖的組方中?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明:山茱萸所含的糖蛋白、熊果酸、齊墩果酸、多糖、苷類、鞣質(zhì)和環(huán)烯醚萜類等成分都具有降血糖效果［4－11］。α－葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制小腸黏膜刷狀緣α－葡萄糖苷酶對(duì)食物中淀粉和糖類的降解，延遲并減少葡萄糖的吸收，從而降低餐后血糖;目前常用的此類降糖藥物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，但價(jià)格高、副反應(yīng)和毒副作用較大，因此從天然動(dòng)植物和礦物中尋找低毒、高效的α－葡萄糖苷酶抑制劑具有廣闊的應(yīng)用前景。

作者采用α－葡萄糖苷酶抑制劑微孔板高通量篩選模型，用單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法對(duì)山茱萸果肉中α－葡萄糖苷酶抑制劑的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為山茱萸果肉中降血糖活性成分的提取及深入開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試山茱萸果肉于2011 年10 月至11 月采集于陜西佛坪，經(jīng)陜西師范大學(xué)植物學(xué)教研室鑒定為山茱萸的干燥成熟果肉，標(biāo)本存放于陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。稱取去核的果肉400 g，粉碎并過40 目篩后備用。

供試的二甲基亞砜(DMSO)、α－葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)和4－硝基苯－α－D－吡喃葡萄糖苷(PNPG)均為美國Sigma公司出品，其余試劑均為分析純。Anthos Zenyth 3100 酶標(biāo)儀產(chǎn)自北京惠安澤泰科技有限公司，RE－52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀產(chǎn)自上海亞榮生化儀器廠，XH－B 型旋渦混合器產(chǎn)自姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司，KQ－600DB 臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器產(chǎn)自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山茱萸果肉提取液的基礎(chǔ)制備流程 準(zhǔn)確稱取果肉粗粉 0.5 g，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求按料液比(W ∶V)1∶10 加入體積分?jǐn)?shù)40%乙醇，振蕩搖勻，放置3 h 后在30 ℃、420 W 條件下超聲處理20 min，抽濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10 mL，加入乙醚萃取油脂后靜置10 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醚味，即為果肉提取液，可直接用于α－葡萄糖苷酶活性抑制率的測(cè)定。

1.2.2 α－葡萄糖苷酶活性測(cè)定 參照文獻(xiàn)［12］的方法略加優(yōu)化。在96 微孔板上每孔加0.1 mmol·L－1磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)180 μL，及 α－葡萄糖苷酶 15 μL 和提取液 4 μL，混勻后于37 ℃恒溫處理 15 min;加入10 mmol·L－1PNPG 30 μL，混勻后于37 ℃恒溫反應(yīng)15 min;于波長405 nm 處測(cè) OD值(ODc)。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值，計(jì)算抑制率。另設(shè)對(duì)照組a(用緩沖液代替樣品提取液)、空白對(duì)照組b(用緩沖液代替α－葡萄糖苷酶和樣品提取液)和樣品對(duì)照組d(用緩沖液代替α－葡萄糖苷酶和底物)，其余測(cè)定流程均相同，分別獲得ODa、ODb和ODd，按以下公式計(jì)算抑制率:抑制率(I)=〔1－(ODc－ODd)/(ODa－ODb)〕×100%。此外，設(shè)置阿卡波糖陽性對(duì)照組e，測(cè)定阿卡波糖對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制率。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)上述基礎(chǔ)流程，分別設(shè)置料液比、乙醇濃度、超聲處理溫度和處理時(shí)間4 個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)。其中料液比(W ∶V)分別為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 和 1∶30;乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、40%、60%、80%和100%;超聲處理溫度分別為 20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃ 、60 ℃ 和 70 ℃;超聲處理時(shí)間為 10、20、30、40、50 和 60 min。每一單因素實(shí)驗(yàn)中除涉及的因素外，其余提取流程均與上述基本流程相同，并按上述方法測(cè)定提取液對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制率。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。料液比(W ∶V)為1∶10、1∶15 和1∶25;乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%和50%;超聲處理時(shí)間為30、40 和50 min;超聲處理溫度為50 ℃、60 ℃和70 ℃。按上述基礎(chǔ)流程制備提取液并測(cè)定對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制率;并對(duì)獲取的最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3 次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

用Origin 軟件計(jì)算果肉提取液對(duì)α－葡萄糖苷酶的半抑制濃度(IC50)，并與陽性對(duì)照阿卡波糖的IC50進(jìn)行對(duì)比。采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在料液比、乙醇濃度、超聲處理溫度和時(shí)間不同的條件下獲得的果肉提取液對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制率見圖1。

由圖1－A 可知:隨提取過程中料液比的增大，山茱萸果肉提取液對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制作用增強(qiáng)。其中，料液比1 ∶5 至1∶15，獲得的提取液的抑制率明顯升高;此后，抑制率趨于平穩(wěn)。從成本角度考慮，料液比1∶15 比較適宜。

由圖1－B 可知:提取過程中加入體積分?jǐn)?shù)10% ～40%乙醇，獲得的果肉提取液對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高逐漸增加;用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇提取，獲得的提取液抑制率最大。因此，最適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)約為40%。

圖1 在不同提取條件下獲得的山茱萸果肉提取液對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制率Fig. 1 Inhibition rate of extract from Cornus officinalis Sieb. et Zucc. flesh obtained under different extraction conditions to α-glucosidase activity

由圖1－C 可知:隨提取過程中超聲處理時(shí)間的延長，獲得的果肉提取液對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制率逐漸增大;處理時(shí)間超過40 min，獲得的提取液的抑制率趨于平緩。因此，最佳超聲處理時(shí)間約為40 min。

由圖1－D 可知:隨提取過程中超聲處理溫度的升高，獲得的果肉提取液對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制作用逐漸增強(qiáng);處理溫度高于60 ℃，獲得的提取液的抑制率趨于平緩。所以，最適宜的超聲處理溫度約為60 ℃。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及最佳提取條件的驗(yàn)證

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表1):不同提取因素與山茱萸果肉提取液對(duì)α－葡萄糖苷酶活性抑制率有不同程度的關(guān)系，其中超聲處理溫度對(duì)α－葡萄糖苷酶活性抑制率的影響程度最大，而超聲處理時(shí)間的影響程度最小。根據(jù)K 值推測(cè)山茱萸果肉的最優(yōu)提取條件為 D3C2A3B1，即料液比 1∶15(W ∶V)、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲處理溫度70 ℃、超聲處理時(shí)間30 min。

表1 山茱萸果肉提取液不同提取條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of orthogonal experiment of different extraction conditions of extract from Cornus officinalis Sieb. et Zucc. flesh

根據(jù)前述最優(yōu)提取條件重復(fù)提取3 次，獲得的果肉提取液對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制率分別為98.39%、98.43%和98.40%，平均值為 98.41%，RSD 為 0.021%，說明該提取條件穩(wěn)定，且重現(xiàn)性良好。

將山茱萸果肉提取液配制成不同濃度并測(cè)其對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制率，其 IC50為409.30 mg·L－1，遠(yuǎn)低于陽性對(duì)照品阿卡波糖的IC50(890.48 mg·L－1)，說明采用最佳提取條件獲得的果肉提取液對(duì)α－葡萄糖苷酶活性抑制作用明顯。

3 結(jié) 論

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在料液比1∶15、加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇、超聲處理溫度70 ℃和超聲處理時(shí)間30 min 的條件下獲得的山茱萸果肉提取液對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制率最高，達(dá)98.5%。該提取條件穩(wěn)定且重現(xiàn)性好。

山茱萸營養(yǎng)與藥用價(jià)值均較高;山茱萸醇提物對(duì)糖尿病大鼠有明顯的降糖作用，但對(duì)正常大鼠血糖無明顯影響，且山茱萸總萜可以提高正常小鼠糖耐量，降低四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的血糖值，提高血清胰島素水平［11］。因而，對(duì)山茱萸降糖作用的深入研究將有廣泛的應(yīng)用前景。

［1］王花紅，郭五保，顧 瑩，等. 山茱萸藥材指紋圖譜的研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2004，24(10):1922－1928.

［2］于 淼，王曉先，賈 琳. 山茱萸的藥理作用研究進(jìn)展［J］. 東南國防醫(yī)藥，2010，12(3):240－243，260.

［3］高大威，范玉生，李 娜，等. 山茱萸活性成分的鑒定及降糖效果的研究［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008(12):92－94.

［4］唐成康，高小平，徐大勇，等. 山茱萸糖蛋白的純化及部分理化性質(zhì)研究［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17(12):147－151.

［5］HSU J H，WU Y C，LIU I M，et al. Release of acetylcholine to raise insulin secretion in Wistar rats by oleanolic acid，one of the active principles contained in Cornus officinalis［J］. Neuroscience Letters，2006，404:112－116.

［6］許惠琴，朱 荃. 山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病的保護(hù)作用［J］. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19(6):342－344.

［7］馬慶一，陳麗華，楊海延，等. 山茱萸中α－葡萄糖苷酶抑制活性因子的篩選(Ⅰ)［J］. 食品科學(xué)，2007，28(1):167－170.

［8］YOKOZAWA T，YAMABE N，KIMH Y，et al. Protective effects of morroniside isolated from Corni Fructus against renal damage in streptozotocin-induced diabetic rats［J］. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2008，31:1422－1428.

［9］YAMABE N，NOH J S，PARK C H，et al. Evaluation of loganin，iridoid glycoside from Corni Fructus， on hepatic and renal glucolipotoxicity and inflammation in type 2 diabetic db/db mice［J］. European Journal of Pharmacology，2010，648:179－187.

［10］YAMABE N，KANG K S，GOTO E，et al. Beneficial effect of Corni Fructus， a constituent of Hachimi-ji-gan， on advanced glycation end-product-mediated renal injury in Streptozotocintreated diabetic rats［J］. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2007，30:520－526.

［11］韓璟超，季 暉，薛城鋒，等. 山茱萸總萜的降血糖作用［J］.中國天然藥物，2006，4(2):125－129.

［12］張 麗. 滇丁香、茜草抑制α－葡萄糖苷酶活性成分研究［D］.開封:河南大學(xué)藥學(xué)院，2007:4－5.