李海芬，陳小平，洪彥彬，劉海燕，李 玲，梁炫強(qiáng)*

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，廣東廣州510640;2. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)院，廣東廣州510631)

花生(Arachis hypogaea L.)在植物界中具一個(gè)獨(dú)特的“地上開(kāi)花，地下結(jié)果”生長(zhǎng)現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱(chēng)“花生果針向地性”.花生果針在花生整個(gè)生育周期中發(fā)揮重要的作用，花生胚珠一旦授精，果針就攜帶幼小的種子(受精胚珠)伸長(zhǎng)，并呈向下生長(zhǎng)，進(jìn)入土壤后幼小的種子發(fā)育成熟形成莢果［1］.

自19 世紀(jì)末，DARWIN［2］首次描述花生果針向地性以及果針生長(zhǎng)過(guò)程和環(huán)境條件以來(lái)，有關(guān)果針向地性的問(wèn)題一直引起人們的關(guān)注［3－5］. 花生果針和莢果的整個(gè)生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程受到各種內(nèi)源激素的調(diào)節(jié). SHUSHU 等［6］對(duì)吲哚乙酸(IAA)，赤霉素(GA)和細(xì)胞分裂素(CTK)在果針生長(zhǎng)過(guò)程中的作用進(jìn)行了研究，認(rèn)為IAA 和GA 對(duì)果針的伸長(zhǎng)起作用，CTK 則主要作用于果針細(xì)胞分裂的早期階段.SHLAMOVITZ 等［7］發(fā)現(xiàn)乙烯在果針入土過(guò)程中有輕微增加，IAA 在整個(gè)過(guò)程中保持不變，脫落酸則在入土后減少了5 倍之多. 但這些研究主要集中于植物內(nèi)源激素在花生莢果形成的整個(gè)過(guò)程中所起的作用.由于實(shí)驗(yàn)條件的制約，有關(guān)植物內(nèi)源激素與果針向性關(guān)系的研究除了少數(shù)集中于IAA，對(duì)于其他激素的研究報(bào)道尚少.

本文以授粉后12～15 d 的果針為材料，采用離體培養(yǎng)的方式，通過(guò)比較正置(果針尖端向下，與自然生長(zhǎng)方向一樣)和倒置(果針尖端向上，與自然生長(zhǎng)方向相反)離體培養(yǎng)果針生長(zhǎng)早期發(fā)生向地性反應(yīng)時(shí)主要植物內(nèi)源激素(IAA、GA、ABA 和CTK)的差異，研究?jī)?nèi)源激素與果針向地性的關(guān)系，這對(duì)了解花生果針向地性機(jī)理具有一定的理論意義.

1 材料和方法

1.1 植物材料及處理

供試花生(Arachis hypogaea L.)品種為粵油7號(hào)，由廣東省農(nóng)科院作物研究所提供.2010年春季大田栽培，按正常方式管理.在開(kāi)花后12 d，選取健壯植株第2 節(jié)位，長(zhǎng)約4～5 cm，生長(zhǎng)粗細(xì)一致的花生果針，自來(lái)水沖洗干凈，體積分?jǐn)?shù)為70%酒精表面消毒5 s，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%升汞表面消毒10 min，無(wú)菌水沖洗3 次，然后將果針頂端1 cm(帶子房和部分子房柄)切下，分別進(jìn)行正置(果針頂端朝下，以D 表示)與倒置(果針頂端朝上，以U 表示)垂直插入培養(yǎng)基(約0.3 cm)中，置人工氣候箱中避光離體培養(yǎng)6、12 h 之后，分別切取果針頂部(約6～8 mm)，備用.每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次.

1.2 內(nèi)源激素的測(cè)定

1.2.1 內(nèi)源激素的提取 稱(chēng)取新鮮樣品1 g(圖2～圖5 數(shù)據(jù)都以鮮重計(jì))于研缽，加入少許的抗氧化劑二乙基二硫代氨基甲酸鈉，將冷凍后的樣品在液氮中研成粉末;加入5 mL 體積分?jǐn)?shù)(下同)為80%的冷甲醇溶液，密封4 ℃下靜置浸提12 h，離心30 min(2 000 r/min)取上清液;加3 mL 80%的冷甲醇溶液振蕩搖勻數(shù)小時(shí)，離心20 min 取上清液，將其真空冷凍離心，40 ℃下旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)，除去甲醇;采用等體積的三氯甲烷萃取3 次，去除色素，水相用1 mol/L HCl 將pH 調(diào)至2.5～2.8;用等體積乙酸乙酯萃取3 次，將萃取獲得水相(下層)與乙酸乙酯(上層)分別合并(水相合并，乙酸乙酯相合并). 將水相調(diào)pH 8.0～8.5，用水飽和正丁醇(體積分?jǐn)?shù)85%)萃取3 次，棄水相. 正丁醇相用氮?dú)獯蹈?，殘留物?00 μL 100%甲醇溶解，過(guò)0.45 μm 有機(jī)濾膜后進(jìn)行HPLC 分析(6－BA). 乙酸乙酯相旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)(40 ℃)，殘留物用500μL 100%甲醇溶解，過(guò)0.45 μm 有機(jī)濾膜后進(jìn)行HPLC 分析(IAA、ABA、GA3).

1.2.2 內(nèi)源激素的檢測(cè)與分析 用LC－6A 高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定.檢測(cè)器為紫外可見(jiàn)型SPD－6AV，色譜柱Kromasil C18 (150 mm×4.6 mm，5 μrn)，標(biāo)樣IAA、GA3、ABA、6－BA 均為Fluka 高效液相色譜儀專(zhuān)用試劑，所用色譜甲醇和乙腈均為德國(guó)默克公司生產(chǎn).檢測(cè)條件:1 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL.以標(biāo)樣出峰時(shí)間和峰高疊加定性，外標(biāo)法峰面積定量，按照以下公式計(jì)算:

每個(gè)處理檢測(cè)3 次，統(tǒng)計(jì)時(shí)取平均數(shù)，并按統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行差異顯著性測(cè)定.

2 結(jié)果與分析

2.1 離體培養(yǎng)花生果針向地性反應(yīng)

將離體果針以不同角度(圖1)插入不含任何激素的MS 培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)6 h 后，除了正置培養(yǎng)(與果針自然生長(zhǎng)狀態(tài)一樣)的果針外，其它以不同角度插入離體培養(yǎng)的果針均發(fā)生不同程度的向地性彎曲;離體培養(yǎng)12 h 后彎曲程度加深，倒置果針發(fā)生90°彎曲，顯著呈正向性反應(yīng).

圖1 不同角度離體培養(yǎng)12 h 后的花生果針Figure 1 Peanut gynophores grown in vitro with different angles at 12 h of culture

2.2 正置與倒置離體培養(yǎng)花生果針內(nèi)源激素的變化

為了解花生果針在向地性彎曲過(guò)程中主要內(nèi)源激素的變化規(guī)律，以正置和倒置離體培養(yǎng)6 h 和12 h的果針為材料分別檢測(cè)GA3、IAA、ABA 和6－BA 等含量的變化規(guī)律.

2.2.1 GA3質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異分析 正?；铙w果針GA3質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為3 674 μg/g(圖2). 正置果針培養(yǎng)6 h 后，GA3質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)6 046 μg/g，提高65%(P＜0.05);培養(yǎng)12 h 后，下降到2 669 μg/g. 與正置相反，倒置果針培養(yǎng)6 h 后，GA3質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有上升;12 h 后，達(dá)5 306 μg/g，較正置同期增加88%，差異顯著(P ＜0.05)，初步表明GA3濃度變化與果針向地性彎曲有關(guān).

圖2 果針正置和倒置離體培養(yǎng)6 h 和12 h 內(nèi)源GA3 質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Figure 2 Change of GA3 content in peanut gynophores grown in vitro with tip pointing upward at 6 h，12 h，and downward at 6 h and 12 h

2.2.2 IAA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異分析 果針I(yè)AA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，正置和倒置果針在離體培養(yǎng)過(guò)程中，IAA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)雖然有所變化，但未達(dá)顯著標(biāo)準(zhǔn)(P ＞0.05)(圖3).

圖3 果針正置和倒置離體培養(yǎng)6 h 和12 h 內(nèi)源IAA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Figure 3 Change of IAA content in peanut gynophores grown in vitro with tip pointing upward at 6 h，12 h，and downward at 6 h and 12 h

2.2.3 ABA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異分析 ABA 在果針中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，果針在正置生長(zhǎng)過(guò)程中，ABA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，正置12 h 后增加了80%，并達(dá)顯著水平(P ＜0.05)(圖4);而倒置果針離體培養(yǎng)并發(fā)生果針彎曲后，ABA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐下降，但未達(dá)顯著水平(P ＞0.05)，顯示ABA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)度變化可能與果針向地彎曲有關(guān).

圖4 果針正置和倒置離體6 h 和12 h 內(nèi)源ABA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化分析Figure 4 Change of ABA content in peanut gynophores grown in vitro with tip pointing upward at 6 h，12 h，and downward at 6 h and 12 h

2.2.4 6－BA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異分析 離體正置果針在培養(yǎng)的12 h 內(nèi)，6－BA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)緩慢減少，未達(dá)顯著水平(P ＞0.05)(圖5);與此相反，倒置果針在離體培養(yǎng)12 h 后，6－BA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)61.9 μg/g，是正置同期的7.2 倍(P ＜0.05)，表明CTK 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化與果針向地性彎曲、細(xì)胞分裂活動(dòng)加劇有關(guān).

圖5 果針正置和倒置離體6 h 和12 h 內(nèi)源6－BA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化分析Figure 5 Change of 6－BA content in peanut gynophores grown in vitro with tip pointing upward at 6 h，12 h，and downward at 6 h and 12 h

3 討論

花生地下結(jié)實(shí)性是植物獨(dú)特的一種現(xiàn)象，引起眾多學(xué)者的關(guān)注.一直以來(lái)，研究花生向地性均以活體果針為材料，但受限于個(gè)體發(fā)育時(shí)期和實(shí)驗(yàn)處理等因素，相關(guān)的研究開(kāi)展并不多.本文采用果針離體培養(yǎng)的方式研究向地性，發(fā)現(xiàn)離體果針能夠自主吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)維持自身正常生長(zhǎng)，并能感受重力刺激呈明顯的正向地性反應(yīng)，因此花生果針離體培養(yǎng)是研究植物組織和器官正向地性的最好材料和方式.

植物激素作為執(zhí)行細(xì)胞通訊的化學(xué)信息在代謝、生長(zhǎng)、形態(tài)建成等植物生理活動(dòng)的各個(gè)方面均起著十分重要的作用.由于IAA 的功能主要與植物細(xì)胞分裂，細(xì)胞生長(zhǎng)，極性反應(yīng)和誘導(dǎo)果實(shí)座果有關(guān)［8］，因此前期有關(guān)果針向地性研究主要集中于IAA［6，9－10］.相關(guān)的研究表明IAA 產(chǎn)生于果針頂端并作用于莢果發(fā)育的整個(gè)過(guò)程. 切除果針頂端或人工施用IAA 轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑能顯著抑制果針生長(zhǎng)，而施用一定數(shù)量的IAA 于果針切口端可使果針恢復(fù)生長(zhǎng)［6，11－12］.同樣，去除頂端的果針施用IAA 可使果針 發(fā) 生 向 地 性 彎 曲［13］. MOCTEZUMA 和FELDMAN［14］發(fā)現(xiàn)當(dāng)活體果針?biāo)椒胖脮r(shí)，IAA 主要聚集果針遠(yuǎn)地面一側(cè)的皮層和表皮細(xì)胞，而在近地面一側(cè)卻檢測(cè)不到，因此認(rèn)為高濃度IAA 在果針生長(zhǎng)最快部位的聚集是引起果針向地性彎曲的原因之一.另外，在本研究中作者發(fā)現(xiàn)6－BA 在倒置過(guò)程中顯著增加，因此推測(cè)其可能與果針發(fā)生彎曲時(shí)細(xì)胞分裂有關(guān)，這與SHUSHU 等［6］所認(rèn)為的細(xì)胞分裂素主要作用于果針細(xì)胞分裂的早期階段一致.同時(shí)ALONI［15］也認(rèn)為在擬南芥根向地性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中，細(xì)胞分裂素參與了從根冠到伸長(zhǎng)區(qū)的信號(hào)傳導(dǎo). 但目前有關(guān)赤霉素和脫落酸在花生果針向地性過(guò)程中的作用未見(jiàn)報(bào)道.

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