谷 峻 ，張靜苗，張碧瑤，馬杏賢，李良冰，吳燕玲

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510631)

廣金錢草(Desmodium styracifolium)是豆科植物山螞蝗屬中的一種，其干燥地上部分為常用傳統(tǒng)中藥，收載于中華人民共和國(guó)藥典［1］，其味甘、性涼、具有清熱和利尿的功效，可用于治療泌尿系統(tǒng)感染、尿路結(jié)石和膽石癥等. 廣金錢草主產(chǎn)于廣東、廣西、海南等地［1］. 近些年隨著其療效被確認(rèn)，對(duì)廣金錢草需求量逐年增加，使得其野生資源不斷減少.也是目前中藥材生產(chǎn)的主要方法. 隨著廣金錢草的連年種植，病害發(fā)生日益嚴(yán)重［2］. 迄今為止，國(guó)際上對(duì)重要的土傳病害還沒(méi)有十分有效的防治方法，然而伴隨著土壤微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者提出利用土壤中的有益微生物種群與有害微生物的競(jìng)爭(zhēng)、拮抗、捕食等生態(tài)學(xué)關(guān)系，使有益微生物類群占據(jù)有利的生態(tài)位，可能是控制土傳病害的有效途徑［3－5］.根瘤菌作為與豆科植物共生的一類有益微生物類群，一旦與宿主建立共生體后，能夠?yàn)樗拗魈峁┥L(zhǎng)必需的氮素營(yíng)養(yǎng)，增加宿主的抗逆性.然而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)廣金錢草根瘤菌的研究還未見(jiàn)報(bào)道.

篩選抗逆性強(qiáng)的根瘤菌菌株是獲得優(yōu)良的豆科植物－生物固氮共生體系的前提，本文研究了廣金錢草根瘤菌對(duì)不同鹽度、溫度、酸堿度和重金屬耐受性等生物學(xué)特性.BOX－PCR 是一項(xiàng)可靠的、相對(duì)穩(wěn)定的基于基因組水平的指紋圖譜分析手段，它是根據(jù)廣泛存在于細(xì)菌基因組中的短重復(fù)序列(BOX)的保守性來(lái)設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增位于重復(fù)序列間的不同片段，近年來(lái)被廣泛地用于高效根瘤菌菌株的田間篩選標(biāo)記［6－8］. 獲得的結(jié)果能進(jìn)一步明確廣金錢草根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育地位和遺傳多樣性，本研究選取代表菌株測(cè)定了其recA 基因序列并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.為進(jìn)一步篩選與廣金錢草共生的高效固氮體系，提高廣金錢草的產(chǎn)量和品質(zhì)提供優(yōu)良的種質(zhì)資源.

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

PCR 試劑及轉(zhuǎn)化試劑均購(gòu)自大連寶生物公司，Axygen 凝膠回收試劑盒和DNA 提取試劑盒分別購(gòu)自誼橋生物科技公司及美津生物科技有限公司(廣州). PTC100 PCR 擴(kuò)增儀(MJ Research 公司，美國(guó))，高速冷凍離心機(jī)Eppendorf 5417R (Eppendorf，美國(guó)). 本研究使用的引物由北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司合成，BOX－PCR 所用引物序列為5’－ CTACGGCAAGGCGACGCTGACG－3’［9］，recA 基 因 擴(kuò) 增 引 物 為41F5’－ TTCGGCAAGGGMTCGRTSATG－ 3’，640R5’－ ACATSACRCCGATCTTCATGC－3’［10］.

1.2 供試菌株

采用土壤捕捉法獲得根瘤，土壤為磚紅壤，pH值5.5;在實(shí)驗(yàn)室條件下將獲得的新鮮根瘤經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇表面消毒1 min，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液浸泡1 min 后，無(wú)菌水沖洗3次，將根瘤切開(kāi)后在YMA 平板上劃線分離，于28～30 ℃培養(yǎng)7～10 d，將長(zhǎng)出的根瘤菌經(jīng)平板劃線和顯微鏡鏡檢后，獲得根瘤菌純菌株并接種YMA 斜面培養(yǎng)后，4 ℃冰箱保藏備用. 將分離的菌株經(jīng)活化后，收集新鮮菌體回接于經(jīng)低氮培養(yǎng)液生長(zhǎng)的廣金錢草植株上，經(jīng)結(jié)瘤試驗(yàn)確定為廣金錢草根瘤菌.供試菌株及參比菌株見(jiàn)表1，其中慢生參比菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院陳文新課題組饋贈(zèng).

本研究所用的廣金錢草種子購(gòu)買于廣東南方中藥材種苗基地.

表1 供試菌株一覽表Table 1 The rhizobial strains used in this study

1.3 供試菌株的抗逆性測(cè)定

供試菌株經(jīng)YMA 平板活化后，接種至各YMA供試平板上.耐鹽試驗(yàn)NaCl 的終質(zhì)量分?jǐn)?shù)(下同)為1.0%～4.0%;pH 耐受試驗(yàn)分別為4、5、9、10、11.溫度耐受性分別于4、10、40 ℃培養(yǎng)5～15 d，觀察并記錄結(jié)果;在YMA 培養(yǎng)基中分別添加重金屬Zn2+，Cu2+，Pb2+，及Zn2+/ Pb2+的組合至終濃度為4 mmol/L，測(cè)定供試菌株對(duì)不同重金屬的耐受性.接種后于28 ℃黑暗培養(yǎng)7～10 d、觀察和記錄菌株生長(zhǎng)情況.

1.4 遺傳多樣性分析

1.4.1 總DNA 的提取 供試菌株經(jīng)YMA 斜面活化后，接種于5 mL YMA 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)5～7 d，取1.5 mL 菌液于10 000 r/min 收集菌體，按照試劑盒說(shuō)明書提取總DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的DNA 濃度，使用前經(jīng)稀釋至50 ng/μL.

1.4.2 BOX－PCR 指紋圖譜分析 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)按文獻(xiàn)［11］的要求加入PCR 反應(yīng)各組分，按PCR循環(huán)程序進(jìn)行擴(kuò)增. 取8～10 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖電泳確定擴(kuò)增效果. 在凝膠成像儀中掃描凝膠，將指紋圖譜用TIFF 文件保存. 圖像信息利用GelcomparII(version 3.5)分析軟件，采用平均連鎖法(UPGMA)聚類，最后得到供試菌株和參比菌株的聚類樹(shù)狀圖［12］.

1.4.3 recA 基因擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析 recA 基因擴(kuò)增程序:95 ℃3 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃5 min. 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度，經(jīng)凝膠回收純化后，與載體pMD18－T 連接，采用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，采用藍(lán)白斑法和PCR 法檢測(cè)陽(yáng)性克隆. 將獲得的陽(yáng)性克隆送至北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分部測(cè)序. 將測(cè)序獲得recA 基因序列及Gen-Bank 中獲得的根瘤菌參比菌株的相應(yīng)基因序列經(jīng)Clustal X 軟件序列比對(duì)后，采用Mega4.0 軟件中的鄰接法(Neighbor－joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，自展值(bootstrap)為1 000［12］.

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌對(duì)不同鹽度、pH 和溫度的耐受性

供試菌株均能夠在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)(下同)為1%NaCl 的YMA 平板上生長(zhǎng)，僅有2 株菌能夠耐受2%NaCl，所有的供試菌在高于3%NaCl 的YMA 平板上無(wú)法生長(zhǎng)(表2)，在pH 5 和pH 9 的條件下能夠生長(zhǎng)，pH 4 和pH 10 的YMA 上不能生長(zhǎng). 此外，供試菌株對(duì)不同溫度表現(xiàn)出了不同的耐受性，分別有4株和10 株根瘤菌在4 ℃和10 ℃條件下能夠生長(zhǎng)，僅有1 株供試菌在40 ℃下生長(zhǎng).

表2 供試菌株在不同NaCl、pH 及溫度下的生長(zhǎng)情況Table 2 The growth of the tested strains in different NaCl、pH and temperatures

2.2 根瘤菌對(duì)不同重金屬的耐受性

供試菌株對(duì)4 mmol/L 的Zn2+、Pb2+及Pb2+/Zn2+均有很好的耐受性(表3). 2 株廣金錢草根瘤菌能夠在含有4 mmol/L Cu2+的YMA 平板上生長(zhǎng).廣金錢草根瘤菌菌株對(duì)重金屬Pb2+、Zn2+的耐受性要強(qiáng)于Cu2+的耐受性.

表3 供試菌株對(duì)不同重金屬的耐受性Table 3 The resistance of the tested strains to different heavy metals

2.3 廣金錢草根瘤菌的BOX－PCR 指紋圖譜分析

對(duì)14 株廣金錢草根瘤菌和6 株慢生根瘤菌參比菌株進(jìn)行了指紋圖譜擴(kuò)增和聚類分析(圖1)，在79%的相似水平上，有12 株慢生廣金錢草根瘤菌的BOX－PCR 指紋圖譜與參比菌株埃氏慢生根瘤菌(B.elkanii)在90%的相似水平上聚類形成1個(gè)分支，表明與廣金錢草共生的慢生根瘤菌在基因組水平上與埃氏慢生根瘤菌B.elkanii 更為相近.在91%的相似水平上該分支可分成3個(gè)亞分支，其中亞分支1 由5 株廣金錢草慢生根瘤菌構(gòu)成，亞分支2 由4株廣金錢草根瘤菌和1 株參比菌株埃氏慢生根瘤菌B.elkanii 聚群，另有3 株慢生根瘤菌構(gòu)成亞分支3.而其余2 株廣金錢草根瘤菌未與已知的參比菌株聚在一起.

圖1 廣金錢草根瘤菌BOX－PCR 指紋圖譜聚類分析Figure 1 The cluster analysis of BOX－PCR fingerprinting for the rhizobia nodulated with D. styracifolium

2.4 基于recA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

recA 基因編碼細(xì)菌DNA 重組蛋白的α 亞基，與細(xì)菌修復(fù)系統(tǒng)發(fā)揮功能相關(guān). 由于該基因編碼的蛋白功能相對(duì)保守，被用于慢生根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育研究中.作者在BOX－PCR 指紋圖譜分析基礎(chǔ)上，選取各亞分支的代表菌株進(jìn)行recA 基因的克隆和測(cè)序，測(cè)序后得到的基因序列長(zhǎng)度均大于500 bp，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2).

測(cè)序的供試9 株代表菌株中，共有8 株菌位于B.elkanii 和B.pachyrhizi 構(gòu)成的系統(tǒng)發(fā)育分支上，其中3 株慢生根瘤菌SCNU2、SCNU5 和SCNU6 位于B.elkanii 系統(tǒng)發(fā)育亞分支上，菌株SCNU2 和SCNU5的序列同源性為100%，慢生根瘤菌SCNU4、SCNU7和SCNU13 位于B. pachyrhizi 系統(tǒng)發(fā)育亞分支上;慢生根瘤菌SCNU3 和SCNU9 雖然位于B.elkanii 和B. pachyrhizi 構(gòu)成的系統(tǒng)發(fā)育發(fā)育分支上，但各自成為1個(gè)獨(dú)立的亞分支;僅有1 株菌位于快生型根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育分支上，與已知種Rhizobium leguminosarum USDA2671T序列同源性高，約為90%.

圖2 以recA 基因部分序列構(gòu)建的廣金錢草根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree of recA gene showing the relationships among therhizobial isolates from Desmodium styacifolium and the related species

3 討論

近年來(lái)，隨著廣金錢草規(guī)范化種植基地的建立，已經(jīng)對(duì)廣金錢草種植中的種質(zhì)資源、生物學(xué)特性、種植技術(shù)、田間管理及藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)等問(wèn)題開(kāi)展研究，并制定出了規(guī)范化生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程［13－15］. 然而，與廣金錢草共生的根瘤菌對(duì)宿主在生長(zhǎng)過(guò)程中及最終藥材品質(zhì)的影響幾乎未有涉及，并且對(duì)廣金錢草根瘤菌的資源也未見(jiàn)報(bào)道. 筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)，分布于我國(guó)不同地區(qū)的山螞蝗屬豆科植物的根瘤菌主要以慢生根瘤菌為主，其中埃氏慢生根瘤菌為優(yōu)勢(shì)種群［12］.前期的研究未涉及宿主山螞蝗屬中的廣金錢草根瘤菌的資源狀況.本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在華南地區(qū)的磚紅壤中與廣金錢草共生的根瘤菌也多與埃氏慢生根瘤菌親緣關(guān)系近，recA 基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，3 株慢生根瘤菌位于埃氏慢生根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育分支，另有2 株處于獨(dú)立的系統(tǒng)發(fā)育分支，可能代表新的慢生根瘤菌種群，需要進(jìn)一步擴(kuò)大種群來(lái)確定.

與分離自其它宿主豆科植物的根瘤菌相比，本研究分離到的廣金錢草根瘤菌對(duì)鹽的耐受性普遍較弱，這一結(jié)果與分離自不同地區(qū)山螞蝗屬其它種宿主植物的根瘤菌耐鹽性一致［16－17］. 徐開(kāi)未等［16］研究分離自金沙江干熱河谷區(qū)的山螞蝗屬根瘤菌抗逆性時(shí)發(fā)現(xiàn)，山螞蝗屬根瘤菌有較強(qiáng)的抗低溫和抗熱的能力;本研究表明廣金錢草根瘤菌對(duì)低溫的耐受性較強(qiáng)而對(duì)高溫的耐受性弱，僅1 株菌能夠在40 ℃生長(zhǎng)，其它根瘤菌均無(wú)法耐受40 ℃. 重金屬耐性分析表明，廣金錢草根瘤菌對(duì)不同重金屬有良好的耐受性和抗性，并且對(duì)鋅、鉛單鹽和其雙鹽在4 mmol/L 下都有很好的耐受性，這與繆?？〉龋?7］的研究結(jié)果較一致.

此外，本研究采用了BOX－PCR 技術(shù)對(duì)廣金錢草根瘤菌的遺傳多樣性進(jìn)行分析，一方面揭示了廣金錢草根瘤菌在基因組水平上的多樣性，同時(shí)也為下一步田間篩選高效生物固氮體系提供了依據(jù). 由于本研究中分離到的廣金錢草根瘤菌絕大多數(shù)為慢生型，而慢生根瘤菌的16S rDNA 基因序列相似性很高，很難很好的將不同種慢生根瘤菌區(qū)分開(kāi)［18］，因此采用了recA 基因序列分析技術(shù)對(duì)獲得的廣金錢草根瘤菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.BOX－PCR 分析發(fā)現(xiàn)供試的14 株菌中有12 株菌在基因組水平上與埃氏慢生根瘤菌相似，而recA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析將在BOX－PCR 分析中聚群的菌株區(qū)分開(kāi).已有報(bào)道認(rèn)為BOX－PCR 不適用于種群劃分及種屬的界定［8］，本研究結(jié)果表明BOX－PCR 技術(shù)對(duì)慢生根瘤菌不同種群的劃分結(jié)果與recA 基因序列分析獲得的結(jié)果較一致. 這可能與作者采用土壤捕捉法獲得慢生根瘤菌有關(guān)，及分析的種群數(shù)量較少造成的，需要進(jìn)一步擴(kuò)大種群數(shù)量來(lái)比較分析.

致謝:感謝華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馮啟理教授提供儀器以及中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院陳文峰副教授幫助聚類分析.

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