★ 李曉芳 吳榮 葉喜德 (. 江西省中醫(yī)院 南昌330006;. 江西省余干縣人民醫(yī)院 余干33500;3.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌330004;4.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣州50006)
黃芩(Scutelalria baicalensis Georgi)來源于唇形科植物黃芩的干燥根,為多年生草本,主根粗壯,莖高約30 -120 cm,自基部多分枝。黃芩又被稱為黃金茶、山茶根或者爛心草,是臨床上十分常用的中藥,具有良好的瀉火解毒、止血涼血、安胎除熱的作用?,F(xiàn)代研究表明,黃芩富含黃酮類化學(xué)成分,其中主要是黃芩苷(baicalin),黃芩甙藥理作用廣泛,臨床主要用于抗菌、消炎和抗感染[1,7]等。而其莖葉為黃芩藥材的地上部分,主要含有野黃芩苷(scutellarin),該成分具有清熱解毒,擴(kuò)張心腦血管,改善體內(nèi)微循環(huán)等作用[2]。為了黃芩資源的合理利用和生藥(或制劑)的質(zhì)量控制,我們建立了黃芩苷和野黃芩苷的HPLC 分析方法,對黃芩不同部位的主要成分黃芩苷和野黃芩苷的含量進(jìn)行了測定。
HPLC 儀器:LC -20AT 高效液相色譜儀(島津公司,日本),包括SPD-M20A 二極管陣列檢測器,SIL-20A 自動進(jìn)樣器,LC -solution 液相色譜工作站。其它儀器:電子分析天平FA2004,上海天平儀器廠;TDL-5 -A 型低速臺式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;QN -99 粉碎機(jī),韓國日進(jìn)精工有限公司;8002 型恒溫水浴控制器,余姚明偉儀表廠。
甲醇、乙腈為色譜純,乙醇、醋酸、磷酸為分析純,水為自制重蒸水。黃芩苷對照品,購于中國藥品生物制品檢定所(批號:110715 -201016);野黃芩苷對照品,購于北京亞希爾科技有限公司。黃芩根、莖、葉均采購于市場。
2.1 色譜條件 黃芩苷檢測參考藥典方法,并稍作改動:色譜柱為Texra C18 柱(4.6 mm × 200 mm,5 μm),流動相為甲醇-水(53∶47),水用磷酸調(diào)pH值約為3(磷酸∶水=2∶500,V/V),流速為0.9 mL/分,檢測波長280 nm,柱溫30℃,進(jìn)樣量20 μL。
野黃芩苷檢測:色譜柱同黃芩苷檢測,流動相以甲醇-0.2%醋酸溶液進(jìn)行梯度洗脫,0 -30 分鐘甲醇由40%增加到70%;洗脫流速為0.9 mL/分,檢測波長334 nm,柱溫為30℃,進(jìn)樣量10 μL。
2.2 對照品溶液制備 黃芩苷:精密稱取在60℃干燥恒重的黃芩苷對照品6.00 mg,加甲醇定容至100 mL 的容量瓶,配成60 μg/mL 濃度的對照品溶液,用時稀釋至60、24、12、6、3 μg/mL 共5 個濃度梯度。
野黃芩苷:精密稱取在P2O5干燥器中干燥24小時的野黃芩苷對照品10.00 mg,加甲醇定容至25 mL 的容量瓶,配成0.4 mg/mL 濃度的對照品溶液。
2.3 供試品溶液制備 黃芩苷提?。?]:分別精密稱取樣品粉末(過60 目篩)1.00 g,加70%乙醇100 mL,回流提取4 小時,提取液過濾,除去殘渣定容至100 mL 容量瓶中,即得供試樣品。
黃芩苷提?。?]:稱取樣品粉末(過60 目篩)1.00 g,精密稱定,置索氏提取器中用石油醚(60 -90)洗脫至無色,取出,晾干,在索氏提取器中用80 mL甲醇連續(xù)洗脫至無色,使野黃芩苷提取完全,放冷,濾過,濾液置100 mL 容量瓶中,用少量甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器,洗液濾入同一容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。
2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 黃芩苷對照品溶液進(jìn)樣20 μL,按上述色譜條件進(jìn)行測定,對照品色譜圖見圖1(a)。以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),黃芩苷濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y = 0.73×105X -1.5 ×105(r =0.999 8)。結(jié)果表明,進(jìn)樣體積20μL,檢測波長λ280 nm,黃芩苷在1.5 -60 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好[4]。
取濃度為0.400 mg/mL 的野黃芩苷對照品溶液5、10、15、20、25 μL 依次進(jìn)樣,在本文2.1 色譜條件下,測定色譜峰面積,對照品色譜圖見圖1(b)。以對照品質(zhì)量x (μg)為橫坐標(biāo),峰面積Y 為縱坐標(biāo),回歸得直線方程為Y =1.36 ×106X -2.07 ×106(r=0.999 5)。
圖1 對照品色譜圖
2.5 精密度試驗(yàn) 取2.2 項下對照品溶液黃芩苷(6 μg/mL)20 μL 和野黃芩苷(0.4 mg/mL)10 μL,分別連續(xù)進(jìn)樣5 次,結(jié)果黃芩苷的平均峰面積為225601 (RSD =0.35%);野黃芩苷的平均峰面積為3043702 (RSD=0.57%)。
2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3 項下樣品溶液,室溫放置0、4、8、12、16、20、24 小時后測定,結(jié)果測得的黃芩苷和野黃芩苷面積基本不變,RSD 分別為0.59%、0.82%,表明樣品溶液在24 小時之內(nèi)穩(wěn)定。
2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知黃芩苷和野黃芩苷的黃芩莖部樣品100.0 mg 共5 份,各精密加入黃芩苷對照品10.05 mg、野黃芩苷對照品8.05 mg,按樣品溶液制備方法制備,依上述方法測定,結(jié)果黃芩苷、野黃芩苷平均回收率分別為100.04%(RSD=0.75%)和99.26%(RSD=1.21%)。
2.8 樣品測定 按2.3 項,黃芩根、莖、葉配制樣品溶液各3 份[5],依法測定,黃芩苷、野黃芩苷含量及色譜峰出峰時間。結(jié)果見表1。
表1 樣品測定結(jié)果(含量%,n=3)
中藥黃芩的藥用部位為植物黃芩的根,根據(jù)HPLC 分析的結(jié)果,黃芩根中黃芩苷的含量較高,因此可能是黃芩的主要活性成分。本實(shí)驗(yàn)測定的結(jié)果符合2010 年版藥典中規(guī)定黃芩苷含量不得少于9.0%的標(biāo)準(zhǔn),實(shí)際含量為10.872%,說明市場購買的黃芩藥材質(zhì)量尚可[6]。與文獻(xiàn)[2]中黃芩莖、葉所含的野黃芩苷相比(0.641%),本文所購莖、葉材料中含量更高(分別為2.257%和3.316%),這可能與產(chǎn)地有關(guān)系,不同產(chǎn)地的黃芪藥材中有效成分存在一定的差異[3]。另外,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,黃芩根、莖和葉不同的藥理作用在化學(xué)成分的差異上得到了體現(xiàn)。黃芩莖、葉中黃芩苷的含量較低,主要成分為野黃芩苷,因此莖、葉部位雖然亦可藥用,但不可代替黃芩藥材。
[1]張永欽,周井炎,徐輝碧. 黃芩苷的抗氧化作用[J].華中理工大學(xué)學(xué)報,1999,27 (4):110 - 112.
[2]李守拙,李沈明,范書鐸. 黃芩莖葉中野黃芩苷含量測定[J]. 中草藥,2000,31(12):910 - 912.
[3]劉美蘭,楊立新,萬元浩,等.RP -HPLC 法測定7 種藥用黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷的含量[J]. 藥物分析雜志,2002,22(2):99- 102.
[4]張威,白雁,雷敬,等.衛(wèi)近紅外光譜法測定黃芩提取物中黃芩苷含量[J].計算機(jī)與應(yīng)用化學(xué),2010,27(12):1 697 -1 699.
[5]聶鑫,羅佳波,呂本,等.高效液相色譜法定量分析黃芩醬粗晶中4 種黃酮類成分[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(2):191 -193.
[6]方婧,付梅紅,楊洪軍,等.微波協(xié)助提取在中藥飲片含量測定中的應(yīng)用(1)——微波法與藥典法測定黃芩中黃芩苷含量比較研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué),2011,17(21):46 -48.
[7]魏述永.黃芩有效成分提取物對沙門氏菌的抑菌活性比較研究[J].中國醫(yī)藥雜志,2008,6(5):40 -41.