★ 楊標 施敏 李正紅 楊武亮 陳海芳 嚴志宏 袁金斌＊ 羅小泉 (.江西中醫(yī)學院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌330004;.江西中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院 南昌330004)

馬兜鈴為傳統(tǒng)常用中藥，系馬兜鈴植物北馬兜鈴(Aristolochia contorta Bge.)和馬兜鈴(Aristolochia debilis Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果實，味苦，微辛寒，歸肺、大腸經(jīng)。主要功能有清肺降氣，止咳平喘，清腸消痔，用于肺熱喘咳，痰中帶血，腸熱痔血，痔瘡腫痛［1］。

近年來，關于馬兜鈴酸引起腎損害的報道較多，稱之為馬兜鈴酸腎病(Aristolochic acid nephrosis，AAN)［2－5］。已有多種含馬兜鈴酸的中藥因此被禁用。馬兜鈴中馬兜鈴酸的含量也較高，其毒性應該引起重視，但目前尚無關于馬兜鈴急性毒性的研究報道。炮制是中藥“去毒存效”的重要手段，我們的前期研究［6，7］表明，馬兜鈴經(jīng)蜜炙后其毒性成分有明顯的降低。本實驗對馬兜鈴及其蜜炙品進行半數(shù)致死量的測定，并以確定用藥劑量的可靠性，并探討蜜炙減毒的可能性。

1 試驗儀器與材料

1.1 試驗材料 動物:昆明種小鼠(體重17 －23g)，雌雄各半，由江西中醫(yī)學院工程中心提供，生產(chǎn)許可證號:SYXK (贛)2011 －0001。

材料:東北馬兜鈴購自安徽海鑫中藥飲片有限公司(亳州，安徽)，經(jīng)江西中醫(yī)學院楊武亮教授鑒定為北馬兜鈴(Aristolochia contorta Bge.)的成熟果實;煉蜜為市售。

1.2 儀器設備 電子稱(HZY －6000 －C，福州華志科學儀器有限公司);電煎密閉煎藥機(YJ13B－G YJ20B－G，北京東華原醫(yī)療設備有限責任公司)。

2 試驗方法

2.1 藥物制備

2.1.1 藥材的準備 取馬兜鈴，揀去果柄、除去雜質(zhì)、篩去灰屑。于烘箱烘干(60℃，2 小時)后備用。

2.1.2 蜜炙［6－7］取馬兜鈴生品1.0 kg，用300 g煉蜜(加少量開水稀釋)拌勻，稍悶，待蜜液吸盡，用文火炒至不粘手，顏色加深，有蜜和藥物相混合的氣味溢出時取出放涼，裝至密封袋封口(每100 g 藥材用煉蜜30 g)。

2.1.3 藥材提取液制備 取馬兜鈴生品1.0 kg，加12 倍量水煎煮提取2 小時，濾出提取液，殘渣加8倍量水繼續(xù)提取2 小時，合并兩次濾液，濃縮至1 g(生藥)/mL 的浸膏(比較粘稠，濃度較大)，蜜馬兜鈴同法提取濃縮至1 g(生藥)/mL，置冰箱4℃保存?zhèn)溆?，使用前分別配制成所需濃度。

2.2 急性毒性實驗［8］

2.2.1 預實驗 取小鼠20 只，以4 只為一組(雌雄各半)，分成5 組，選擇劑量間距較大的一系列劑量，分別給各組小鼠以馬兜鈴水提液灌胃，觀察出現(xiàn)的癥狀并記錄死亡數(shù)，找出引起0 －100%死亡率劑量的所在范圍，觀察得到馬兜鈴Dmin=20.2 g/kg·天，Dmax=84.0 g/kg·天;蜜馬兜鈴Dmin=41.0g/kg·天，Dmax=100.0g/kg·天。

2.2.2 正式試驗 在預試驗所獲得的0%和100%致死量的范圍內(nèi)，按等比級數(shù)增減，選用5 個劑量(馬兜鈴劑量組:84.0 g/kg·天、58.8 g/kg·天、41.2g/kg·天、28.8g/kg·天、20.2 g/kg·天，相鄰劑量之間比例為1∶0.7;蜜馬兜鈴劑量組:100.0 g/kg·天、80.0g/kg·天、64.0 g/kg·天、51.2g/kg·天、41.0 g/kg·天，相鄰劑量之比為1∶0.8)，各劑量組動物數(shù)為10 只(雌雄各半)，分別用苦味酸標記。動物根據(jù)體重隨機分配，完成動物分組和劑量計算后按組灌胃給藥。給藥后觀察30 分鐘內(nèi)小鼠活動改變情況和死亡數(shù)，按相應公示計算LD50。

2.2.3 統(tǒng)計學處理 試驗完畢后，統(tǒng)計各組小鼠死亡數(shù)目，計算死亡率p，按孫氏改良寇氏公式計算LD50、LD50的標準誤、LD50 的95%平均可信限，回歸方程LD50= lg－1［χm – i * (ΣP – 0.5)］(χm為最大劑量的對數(shù);i 為相鄰2 組高劑量與低劑量之比的對數(shù);P 為各組死亡率;Σp 為各組動物死亡率的總和);LD50的標準誤Sx50 =i* ［(ΣP – ΣP2 )/(n – 1)］1/2(n 為每組動物數(shù));LD50的95%可信限= lg －1(X50 ±1.96* Sx50 )，(其中X50 =χm– i * (ΣP – 0.5));LD50的平均可信限= LD50±(LD5095%可信限的高限–低限)/2。

3 結果

3.1 小鼠中毒反應 灌胃后30 分鐘內(nèi)，各劑量組小鼠自主活動明顯減少，呼吸先急促，后加深并趨于平緩，眼瞼下垂閉合，偶有驚厥現(xiàn)象，有反轉反射。隨著灌胃持續(xù)，各劑量組小鼠毛色暗淡粗糙，小鼠死亡前有腹式呼吸，俯臥和抽搐現(xiàn)象，反轉發(fā)射消失。

3.2 小鼠死亡率 記錄7 天內(nèi)小鼠的死亡數(shù)和死亡時間，計算死亡率，結果見表1、2。

用寇式改良法計算，得到馬兜鈴的LD50=34.0g/kg·天;95%可信限為42.0 －27.7 g/kg·天;LD50的平均可信限為(34.1 ± 7.2)g/kg·天(P=0.95)。蜜馬兜鈴的LD50=62.6g/kg·天;95%可信限為(55.1 －71.1)g/kg·天;LD50的平均可信限為(62.6 ± 8.0 )g/kg·天(P=0.95)。

表1 馬兜鈴各劑量組灌胃小鼠死亡率

表2 蜜馬兜鈴各劑量組灌胃小鼠死亡率

4 討論

馬兜鈴生品苦寒味劣，易致惡嘔，研究發(fā)現(xiàn)蜜炙后能緩和藥性，增強潤肺止咳功效，且可矯味，避免嘔吐，有“蜜炙甘緩而潤肺”之說［9］。中藥馬兜鈴中主要毒性成分為馬兜鈴酸類物質(zhì)，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)［7］，馬兜鈴經(jīng)蜜炙后馬兜鈴酸類物質(zhì)含量顯著降低，且有新的物質(zhì)生成，或者毒性成分在炮制后發(fā)生了化學反應，使其結構發(fā)生改變，致使其所引起的毒性作用降低或未表現(xiàn)出來。

本次實驗結果顯示，蜜馬兜鈴較馬兜鈴半數(shù)致死量大，約為其1.84 倍，前者約為人臨床用藥劑量的417 倍，后者約為人臨床用藥劑量的227 倍，表明馬兜鈴蜜炙后毒性顯著降低。綜上，馬兜鈴經(jīng)蜜炙后臨床用藥更為安全，馬兜鈴宜蜜炙。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:48 －49.

［2］梅全喜，高玉橋，胡世林. 應理性對待含馬兜鈴酸類中藥［J］. 中國藥房，2006，17(7):554.

［3］Jinbin Yuan，Lihua Nie，Xubiao Luo，et al. Simultaneous determination of nine aristolochic acid analogues in medicinal plants and preparations by high－performance liquid chromatogr － aphy［J］. Talanta，2007，73:644.

［4］Jinbin Yuan，Qian Liu，Guobing Wei，et al. Characterization and determination of six aristolochic acids and three aristololactams in medicinal plants and their preparations by high － performance liquid chromatography － photodiode array detection － mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass spectrometry，2007，21:2 332.

［5］Jinbin Yuan，Qian Liu，Weifeng Zhu，et al. Simultaneous analysis of six aristolochic acids and five aristololatams in herbal plants and their preparations by high－performance liquid chromatography diode array detection fluorescence detection［J］. Journal of Chromatography A，2008，1182:85.

［6］龔千鋒，劉高勝，張的鳳，等. 馬兜鈴炮制前后化學成分的研究［J］.江西中醫(yī)學院學報，2008，20(1):68.

［7］楊標，李正紅，楊武亮，等.不同炮制方法對馬兜鈴中馬兜鈴酸類物質(zhì)含量的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，(10):2 553 －2 555.

［8］陳奇.中藥藥理實驗方法學［M］. 第2 版. 北京:人民衛(wèi)生出社，2006:236 －237.

［9］董立莎，尚明英，蔡少青.馬兜鈴品種－產(chǎn)地考證及炮制歷史沿革的研究［J］.中國中藥雜志，2003，28(10):927.