劉芳寧，梁 琪，喬海軍，楊 敏，張 炎，文鵬程，張衛(wèi)兵，*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學理學院，甘肅蘭州730070)

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)又稱β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，它能夠催化β-D-半乳糖苷化合物中的β-D-半乳糖苷鍵發(fā)生水解，還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷活性。產(chǎn)乳糖酶微生物種類多樣，包括多種細菌、酵母和霉菌［1］。不同微生物來源的乳糖酶酶學性質(zhì)差異很大。酵母所產(chǎn)乳糖酶最適pH接近中性，被廣泛應用于牛乳和乳清中乳糖的水解，但由于是胞內(nèi)酶，不易提取;細菌乳糖酶最適pH接近中性，具有易于發(fā)酵、酶的穩(wěn)定性等優(yōu)勢，但由于安全性問題，在食品工業(yè)中的應用受到了限制;霉菌來源的乳糖酶是胞外酶，提取方便，在p H為2.5～5.4和溫度為50℃左右時，相對活力最高，主要用來處理生產(chǎn)干酪后的酸性乳清［1-3］。目前，乳糖酶在乳品、醫(yī)藥、分析、環(huán)境保護等方面都具有廣闊的應用前景，然而較低的產(chǎn)量限制了乳糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應用。通過遺傳改良選育高產(chǎn)菌株，是實現(xiàn)乳糖酶高效生產(chǎn)的關(guān)鍵。紫外線和氯化鋰是一種操作簡便、效果較好的誘變方法，已經(jīng)成功應用于多種產(chǎn)酶霉菌的菌種選育［4-5］。本研究以米曲霉(ATCC20423)為出發(fā)菌株，采用紫外輻照和紫外復合氯化鋰對其進行誘變選育，以期選育出高產(chǎn)乳糖酶的突變株，為乳糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉菌株(Aspergillus Oryzae) 編號ATCC20423;無水氯化鋰 天津市凱信化學工業(yè)有限公司，分析純;鄰硝基苯 β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG) 北京經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司，分析純;乳糖 上海中秦化學試劑有限公司，分析純;麩皮 蘭州市安寧區(qū)桃海市場，市售。

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯 200g，葡萄糖 20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH自然;誘變培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖 20g，氯化鋰 5～22.5g，瓊脂 20g，蒸餾水1000mL，p H自然;初篩培養(yǎng)基:乳糖 1g，(NH4)2SO41g，KH2PO41.5g，瓊脂 2g，稱取 2g 麩皮，加入 100mL蒸餾水，煮沸10min，用四層紗布過濾，濾液補水至100mL，pH調(diào)至4.8，121℃下滅菌20min后冷卻到60℃，加入微濾除菌的0.1%的ONPG溶液。搖勻后用滅菌的滴管在超凈臺上將其加入滅菌的1.0mL的離心管中，置于冰箱冷藏備用;固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:乳糖 10g，(NH4)2SO410g，KH2PO415g，蒸餾水 1000mL配置成溶液，調(diào)整p H4.8，然后將麩皮粉與上述溶液按1∶1.1(w/v)的比例混合，121℃下滅菌 20min;pH4.5的醋酸緩沖液:把50mL的2mol/L冰醋酸與11.3mL的4mol/L的氫氧化鈉溶液混合，定容至1000mL，并用2mol/L的冰醋酸、4mol/L的氫氧化鈉調(diào)整溶液p H到4.5±0.5。

HH-SZ65型數(shù)顯恒溫水浴鍋 北京醫(yī)療設(shè)備廠;YZ-280型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司;UV-5100型紫外-可見分光光度計 上海分析儀器有限公司;HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;SW-CJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;PHS-3C型數(shù)顯酸度計 上海精密科學儀器有限公司;DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;TGL-20M型高速冷凍離心機長江湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 出發(fā)菌株的活化 將米曲霉菌株接種于PDA斜面進行活化，30℃培養(yǎng)4～5d，待長滿黃綠色孢子后備用。

1.2.2 單孢子懸液的制備 取培養(yǎng)好的斜面，用無菌生理鹽水洗脫孢子后轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的無菌錐形瓶中，充分搖動使孢子散開，用帶脫脂棉的無菌漏斗過濾除去菌絲得到孢子懸液，將孢子濃度調(diào)整到106個/mL。

1.2.3 紫外誘變處理 取5mL孢子懸液置于無菌的直徑6cm的平皿中，在磁力攪拌作用下距30W紫外燈 30cm 處分別照射 7、9、11、13、15、17、19、21min，對每個處理進行梯度稀釋，取0.1mL涂布于平板培養(yǎng)基上，立即用黑布將平板包好，30℃避光恒溫培養(yǎng)4d［6］，計數(shù)并測定菌株酶活，計算致死率和正突變率。

1.2.4 紫外與氯化鋰復合誘變 將紫外誘變后的孢子懸液涂布于含0.5%、0.75%、1.00%、1.25%、1.5%、1.75%、2.00%、2.25%的氯化鋰的誘變培養(yǎng)基平板上，30℃避光培養(yǎng)4d［7-8］，計數(shù)并測定菌株酶活，計算致死率和正突變率。

致死率(%)=(未處理平板菌落數(shù)-處理平板菌落數(shù))/未處理平板菌落數(shù)×100

正突變率(%)=乳糖酶活力提高的菌落數(shù)/誘變后長出的菌落總數(shù)×100

1.2.5 突變株的初篩 將誘變后長出的不同形態(tài)特征的菌落接種到初篩培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3d。向初篩小管中噴灑10%Na2CO3溶液，靜置數(shù)分鐘，挑取顏色較黃小管的菌株，依次轉(zhuǎn)接保存斜面，30℃培養(yǎng)至孢子成熟，于冰箱4℃保藏［9］。

1.2.6 突變株的復篩 將初篩得到的菌株活化后，接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)6d，在室溫下加入5倍體積pH4.5的醋酸緩沖液180r/min振蕩1h，然后用三層紗布過濾，收集濾液，在4℃、10000r/min條件下離心15min，取上清液測定乳糖酶活力，篩選出高產(chǎn)菌株［10］。

1.2.7 突變株遺傳穩(wěn)定性的測定 選取誘變后得到的乳糖酶產(chǎn)量較高的突變株連續(xù)傳代8次，進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后測定乳糖酶活力，判斷其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.8 出發(fā)菌株和突變株的產(chǎn)酶曲線 以出發(fā)菌株和突變株為待測菌株，挑取培養(yǎng)4d的斜面孢子3環(huán)接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)，每隔0.5d測定其酶活力，并繪制產(chǎn)酶曲線。

1.2.9 出發(fā)菌株和突變株的形態(tài)特征比較 將出發(fā)菌株ATCC20423和突變株點植于培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)后，觀察菌落形態(tài)、菌絲體顏色等。

1.2.10 乳糖酶活力的測定 將在45℃下水浴10min的粗酶液0.5mL，加入已預熱至45℃的1.5mL的含50mmol/L ONPG醋酸緩沖液(p H4.5)，在45℃下水浴10min，然后立即加入3.0mL 0.5mol/L的 Na2CO3終止反應［11］。于420nm處測定OD值，測定3次取平均值。以醋酸緩沖液作為空白。一個酶活力單位(U)定義為在上述條件下，每分鐘水解ONPG生成1μmol ONP所需的酶量。

用已知濃度的ONP溶液做標準曲線，根據(jù)ONP的濃度C對應的OD值，利用最小二乘法建立回歸方程:OD=4.5907C+0.021，相關(guān)系數(shù)R=0.9992。

酶活力計算公式:

式中，X為乳糖酶活力(U/mL);C為標準曲線中對應的ONP的濃度(μmol/mL);N為粗酶液稀釋倍數(shù);10為反應時間(min);5為反應體系的總體積(mL);0.5為反應體系加入粗酶液的體積(mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變劑量的確定

出發(fā)菌株經(jīng)紫外線照射不同時間的致死率和正突變率如圖1所示。由圖1可以看出，隨著照射時間的延長，致死率逐漸增加。當處理時間為13min時，致死率為73.49%，當處理時間為21min時，致死率為94.9%。雖然總體菌株的減少減輕了篩選的負擔，但得到的總數(shù)如果太少，選擇的余地就會太小。而且正突變株也并不是隨著致死率的增加，成嚴格的線性關(guān)系。采用紫外線進行誘變時，致死率達到70%～80%時，產(chǎn)生正突變的幾率較高，有利于進一步篩選［12］，所以對致死率在60%～90%的誘變劑量的正突變率進行測定。當紫外線處理時間為15min時，致死率為81.90%，正突變率為5.41%，達到最大值。因此，本實驗采用紫外誘變時間為15min的誘變劑量進行誘變處理。

2.2 紫外線復合氯化鋰誘變劑量的確定

氯化鋰單獨起誘變作用不明顯，但與紫外線復合誘變時可以明顯提高誘變效果，這表明氯化鋰起著促誘變作用［4］。出發(fā)菌株經(jīng)紫外線照射15m in復合氯化鋰誘變的致死率和正突變率如圖2所示，致死率在LiCl質(zhì)量濃度為1.25%范圍內(nèi)遞增，超過該濃度后則上升趨勢緩慢，當LiCl質(zhì)量濃度為2.25%時，致死率為97.68%。正突變率在LiCl質(zhì)量濃度較低的條件下不斷增大，當LiCl質(zhì)量濃度為1.5%時最大，為6.03%，此時致死率為83.68%，因此選擇1.5%的LiCl溶液作為紫外復合氯化鋰的促誘變劑。

表1 紫外照射誘變篩選結(jié)果Table 1 The screening result of UV treatment

表2 紫外照射復合氯化鋰誘變篩選結(jié)果Table 2 The screening result of UV+LiCl treatment

圖1 紫外照射對菌株致死率及正突變率的影響Fig.1 Effects of UV treatment on death rate and positivemutation rate

圖2 紫外照射復合氯化鋰對菌株致死率及正突變率的影響Fig.2 The effect of UV+LiCl treatment on death rate and positivemutation rate

2.3 紫外照射誘變的篩選結(jié)果

通過對米曲霉(ATCC20423)的孢子進行多次紫外照射誘變后，經(jīng)初篩后共獲得13株突變株，突變株在初篩小管中顏色變化情況和復篩測定結(jié)果見表1。相對出發(fā)菌株，這13株突變株的初篩小管顏色較深，其中突變株 UV-15-18、UV-15-20、UV-15-35、UV-15-37的初篩小管顏色加深最明顯。從酶活力測定結(jié)果來看，13株突變株酶活力均比出發(fā)菌株增大。其中UV-15-20的增幅最大，比出發(fā)菌株提高了49.22%。

2.4 紫外照射復合氯化鋰誘變的篩選結(jié)果

通過對米曲霉(ATCC20423)的孢子進行多次紫外照射復合氯化鋰誘變后，經(jīng)初篩后共獲得14株突變株，突變株在初篩小管中顏色變化情況和復篩測定結(jié)果見表2。相對出發(fā)菌株，這14株突變株的初篩小管顏色較深，其中突變株UV-LiCl-27、UV-LiCl-34、UV-LiCl-38的初篩小管顏色加深最明顯。從酶活力測定結(jié)果來看，14株突變株酶活力均比出發(fā)菌株增大。其中UV-LiCl-38的增幅最大，比出發(fā)菌株提高了58.82%。

2.5 突變株的遺傳穩(wěn)定性

對產(chǎn)乳糖酶活力高的突變株UV-15-20和UVLiCl-38連續(xù)傳代8代，進行遺傳穩(wěn)定性實驗，其結(jié)果見表3和表5，方差分析結(jié)果分別見表4和表6。

表4 突變株UV-15-20傳代實驗方差分析Table 4 Variance analysis of generation test ofmutant UV-15-20

由表3和表5可以看出，突變株UV-15-20不同代菌株酶活力變化范圍為113.74～114.53U/m L，變化最大差值為0.79U/m L。突變株UV-LiCl-38不同代菌株酶活力變化范圍120.97～121.99U/m L，變化最大差值為1.01U/m L。通過方差分析(表4和表6)可知，突變株UV-15-20、UV-LiCl-38乳糖酶活力組間差異的p值都大于0.05，說明傳代次數(shù)對兩個突變株乳糖酶活力變化影響不顯著，表明突變株UV-15-20、UV-LiCl-38具有穩(wěn)定的遺傳性。

表3 突變株UV-15-20不同代次的乳糖酶活力(U/mL)Table 3 β-Galactosidase enzyme activity ofmutant UV-15-20 of different generation(U/mL)

表5 突變株UV-LiCl-38不同代次的乳糖酶活力(U/mL)Table 5 β-Galactosidase enzyme activity ofmutant UV-LiCl-38 of different generation(U/mL)

表6 突變株UV-LiCl-38傳代實驗方差分析Table 6 Variance analysis of generation test ofmutant UV-LiCl-38

2.6 出發(fā)菌株和突變株的產(chǎn)酶曲線

突變株與出發(fā)菌株的產(chǎn)酶曲線見圖3。由圖3可以看出，突變株 UV-15-20與出發(fā)菌株ATCC20423的發(fā)酵產(chǎn)酶曲線類似，發(fā)酵1.5d后酶活迅速增加，第6d達到產(chǎn)酶高峰，此時，ATCC20423、UV-15-20的酶活力分別為76.45、114.35U/mL，此后酶活力開始下降，在發(fā)酵過程中突變株UV-15-20的酶活力普遍高于出發(fā)菌株。在發(fā)酵過程中，突變株UV-LiCl-38從第5d開始，產(chǎn)酶速率增加較快，第6d酶活力為120.72U/m L，達到產(chǎn)酶高峰。

圖 3 ATCC20423、UV-15-20和UV-LiCl-38的乳糖酶活力曲線Fig.3 Fermentation curve of lactase from ATCC20423、UV-15-20 and UV-LiCl-38

2.7 出發(fā)菌株和突變株的形態(tài)特征比較

將出發(fā)菌株ATCC20423和突變株UV-15-20、UV-LiCl-38點植于PDA培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)后，觀察菌落形態(tài)、菌絲體顏色等。菌落形態(tài)如圖4所示。培養(yǎng)2d后，可以觀察到出發(fā)菌株和兩株突變株菌落中央的菌絲頂部均長出少量綠色孢子。培養(yǎng)4d后，出發(fā)菌株的菌落直徑為3.8cm，UV-15-20的菌落直徑為3.2cm，UV-LiCl-38的菌落直徑為4.5cm;出發(fā)菌株和突變株UV-15-20已經(jīng)開始大量產(chǎn)生孢子，UV-LiCl-38產(chǎn)生的孢子量較少。培養(yǎng)6d后，整個菌落被綠色的孢子覆蓋，菌落邊緣均為白色菌絲，菌絲體呈白色，菌落質(zhì)地絨毛狀，菌落高度丘狀隆起。

圖4 ATCC20423、UV-15-20、UV-LiCl-38 的菌落形態(tài)Fig.4 The characteristics of colony of ATCC20423、UV-15-20、UV-LiCl-38

3 討論

ONPG離心小管法有效地指導了本實驗的復篩工作。目前，文獻報道的有關(guān)乳糖酶產(chǎn)生菌的篩選方法主要有:X-gal平板法［13］、ONPG 孔板分離法［14］、ONPG離心小管法［15］。X-gal靈敏度高，會導致初篩工作量大且準確率低［16］;霉菌菌落較大，X-gal價格昂貴，采用平板分離法會加大平板的用量，同時也導致X-gal用量增加?？装宸蛛x法和離心小管法以O(shè)NPG為產(chǎn)酶指示劑，與X-gal指示劑法相比，可以避免靈敏度和價格高的問題，孔板分離法易受小孔之間顏色互相干擾、菌株容易污染的影響，離心小管法采用離心小管作為培養(yǎng)小室可以解決污染，顏色干擾的問題［17］。

本實驗將紫外線和氯化鋰結(jié)合使用，誘變效果較好，其乳糖酶活力比出發(fā)菌株提高了58.82%，比使用紫外照射誘變獲得的產(chǎn)乳糖酶能力增加幅度最大的突變株UV-15-20提高了9.6%。乳糖酶產(chǎn)量提高與多種因素有關(guān)，除了菌種自身的遺傳改造外，發(fā)酵條件的優(yōu)化對產(chǎn)酶也有重要的影響［18］。通過發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化來提高產(chǎn)酶量有待進一步研究。

4 結(jié)論

4.1 通過紫外照射對米曲霉進行誘變實驗，確定了最佳紫外照射時間為15min;經(jīng)紫外誘變后，篩選得到一株產(chǎn)乳糖酶能力增加幅度最大的突變株UV-15-20，乳糖酶活力為 114.08U/mL，比出發(fā)菌株提高了49.22%。

4.2 通過紫外線復合氯化鋰對米曲霉進行誘變實驗，確定了最佳紫外照射時間為15min，1.5%的LiCl溶液作為紫外復合氯化鋰的促誘變劑，經(jīng)紫外復合氯化鋰誘變后，經(jīng)篩選得到一株產(chǎn)乳糖酶能力增加幅度最大的突變株 UV-LiCl-38，乳糖酶活力為121.42U/mL，比出發(fā)菌株提高了58.82%。

4.3 對突變株UV-15-20和UV-LiCl-38進行遺傳穩(wěn)定性實驗，結(jié)果表明菌株UV-15-20、UV-LiCl-38具有穩(wěn)定的遺傳性。

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