郭 佳，田 洲，顧 娜，徐 珩，閭 軍*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院肝病與腫瘤生物治療科，北京100069;2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽合肥230032)

眾所周知，絕大多數(shù)腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-associated Antigen，TAA)是自身抗原。因為胸腺的選擇機(jī)制和耐受機(jī)制，機(jī)體針對這些抗原產(chǎn)生的大多數(shù)TCR(T Cell Receptor，TCR)親和力較低，限制了對腫瘤細(xì)胞的識別及殺傷效果。所以，對腫瘤抗原的識別可能是腫瘤免疫研究領(lǐng)域面臨的最大挑戰(zhàn)［1］。近年來基于TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的過繼性免疫治療在眾多腫瘤免疫治療途徑中逐漸引起關(guān)注［2］。NY-ESO-1抗原屬于癌-睪丸抗原(Cancer-testis Antigens，CTA)家族，抗原性強，在多種腫瘤組織表達(dá)［3］，但正常組織中僅睪丸組織表達(dá)。睪丸組織不表達(dá)MHCⅠ類及Ⅱ類分子，所以不會被T細(xì)胞識別殺傷［4］。

本實驗室已構(gòu)建HLA-A2限制性NY-ESO-1特異性TCR質(zhì)粒-pCDNA3.1-ESO-TCR。本研究嘗試將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到HLA-A2+正常人外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中，觀察特異性TCR在細(xì)胞表面表達(dá)情況，并檢測電轉(zhuǎn)后PBMC的體外特異性細(xì)胞毒性作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞

1.1.1 試劑及多肽:pCDNA-3.1-ESO-TCR質(zhì)粒(本實驗室構(gòu)建)、無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒(天根試劑有限公司)、IMSF100無血清培養(yǎng)基(Immunotech UK Ltd)、Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(Norway公司)、1640細(xì)胞培養(yǎng)基(北京鈕因公司)、Recombinant Human IL-2(Peprotech公司)、OKT3(Biolengd公司)和 Human IFN-γELISPOT Kit(U-Cytech公司)等;NY-ESO-1b多肽(-SLLMWITQC-)和flu多肽(-GILGFVFTL-)(均由北京賽百盛公司合成)。

1.1.2 細(xì)胞:經(jīng)供者本人知情同意，由正常人外周血中分離獲得PBMC;NY-ESO-1陽性HepG2細(xì)胞、NYESO-1陰性HepG2細(xì)胞和T2細(xì)胞(均本實驗室保存)。

1.2 p CDNA3.1-ESO-TCR質(zhì)粒提取

操作前將菌種接種于含Amp的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)。180 r/min，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)16 h。按無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒說明書操作提取質(zhì)粒。用紫外分光光度計檢測所提質(zhì)粒濃度及純度。

1.3 p CDNA3.1-ESO-TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)入正常人PBMC

用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離HLA-A2+正常人外周抗凝血10 mL，獲得PBMC。計數(shù)后加入凍存液，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，于液氮中保存。電轉(zhuǎn)前，復(fù)蘇4×106個PBMC，加入4 mL PBMC無血清培養(yǎng)基 (含IL-2終濃度106IU/L，OKT3 5μg/L)吹打成單細(xì)胞懸液，移至12孔板。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)2～3 d。計數(shù)細(xì)胞并移至2支無菌1.5 mL離心管，密度為2 ×106個PBMC/管。標(biāo)記 1#、2#，離心棄上清。將30μg pCDNA3.1-ESO-TCR質(zhì)粒溶于400μL無血清專用培養(yǎng)基，用此混合液重懸1#管細(xì)胞;同時將5μg pCDNA3.1(+)載體加入400μL無血清培養(yǎng)基重懸2#管細(xì)胞，分別移至電轉(zhuǎn)杯。同時計數(shù)2×106個PBMC，電轉(zhuǎn)5μg Pmax-GFP質(zhì)粒作為陽性對照。設(shè)定電轉(zhuǎn)條件220 V-10 ms-5 pulse。電轉(zhuǎn)后將細(xì)胞懸液移至12孔板，每孔加入1.5 mL無血清培養(yǎng)基(含IL-2終濃度106IU/L，OKT3 5 mg/L)，1#為電轉(zhuǎn)pCDNA3.1-ESO-TCR質(zhì)粒的細(xì)胞，以下簡稱ESO-TCR PBMC，2#為電轉(zhuǎn) pCDNA3.1(+)載體的PBMC，以下簡稱空電轉(zhuǎn)PBMC。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。

1.4 體外聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增NY-ESO-1 TCR基因片段

收集細(xì)胞，提取RNA后，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增NY-ESO-1特異性TCR全長片段。上游引物:5'-GGAATTCATGGAGACCCTCT-3';下游引物:5'-ATAG TTTAGCGGCCGCCTAGCCTCTGGAA-3'。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃45 s，35個循環(huán)后72℃延伸5 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段(1 839 bp)。

1.5 流式檢測電轉(zhuǎn)后PBMC細(xì)胞表型

電轉(zhuǎn)后24 h收集已電轉(zhuǎn)GFP質(zhì)粒的PBMC，用流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光蛋白表達(dá)率。收集5×105個空電轉(zhuǎn)PBMC，離心棄上清，用100μL PBS重懸細(xì)胞沉淀后，加入10μL FITC-anti-Vβ13.1充分混勻，避光染色20 min。收集ESO-TCR PBMC至兩支無菌1.5 mL離心管，調(diào)整密度5×105個PBMC/管。離心棄上清后，加入100μL PBS重懸細(xì)胞。分別加入10μL混合熒光抗體CD3Percp/CD4FITC/CD8PE和10μL FITC-anti-Vβ13.1，充分混勻。避光染色20 min后，用3 mL PBS洗滌，離心棄上清。分別向細(xì)胞沉淀加入500μL 4%多聚甲醛，重懸固定。4℃避光保存，經(jīng)流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面標(biāo)志CD3、CD4、CD8和 Vβ13.1的表達(dá)情況。為保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，每次檢測均用鼠IgG2b-FITC同型對照抗體做同型對照。按上述步驟操作，重復(fù)檢測5次ESO-TCR PBMC細(xì)胞表面Vβ13.1表達(dá)情況。

1.6 ELISPOT檢測IFN-γ分泌情況

96孔板中包被捕獲抗體100μL/孔，4℃孵育過夜;扣出捕獲抗體，PBS洗板后，每孔加入100μL封閉液阻斷非特異性結(jié)合位點1 h;用無血清培養(yǎng)基分別重懸細(xì)胞。陽性對照組每孔為空電轉(zhuǎn) PBMC 1×104/100μL(含PHA 10 mg/L);陰性對照組每孔為ESO-TCR PBMC 1×104/100μL;非特異性對照組每孔為1×104個ESO-TCR PBMC細(xì)胞 +1×104個 flu-T2 細(xì) 胞/100μL，flu-T2 細(xì) 胞 為3×104個T2細(xì)胞與20μg flu多肽共培養(yǎng)4 h獲得;空電轉(zhuǎn)組每孔為1×104個空電轉(zhuǎn) PBMC細(xì)胞 +1×104個ESO-T2 細(xì) 胞/100μL，ESO-T2 細(xì) 胞為3×104個T2細(xì)胞與20μg NY-ESO-1b多肽共培養(yǎng)4h獲得;實驗組每孔為1×104個ESO-TCR PBMC細(xì)胞+1×104個ESO-T2細(xì)胞/100μL，ESO-T2細(xì)胞獲取方法同上。以上各組均設(shè)3個復(fù)孔;放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)19 h;用生物素標(biāo)記的抗IFN-γ的單抗孵育2 h(37℃、5%CO2)。用0.05%Tween20-PBS沖洗4次，甩干后加顯色液顯色25 min，用去離子水沖洗，終止顯色。干燥后讀板計數(shù)。

1.7 細(xì)胞毒性實驗

以本實驗室前期構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)NY-ESO-1陽性HepG2細(xì)胞為特異性靶細(xì)胞(簡稱T1)、NY-ESO-1陰性HepG2為非特異性靶細(xì)胞(簡稱T2)。靶細(xì)胞培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基(含10%人AB血清)，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。效應(yīng)細(xì)胞為ESO-TCR PBMC(簡稱E1)、空電轉(zhuǎn)PBMC(簡稱E2)。實驗組效靶比(E1/T1)分別為:4∶1、2∶1、1∶1、0.5∶1;非特異性對照組效靶比(E2/T1)為4∶1;空電轉(zhuǎn)組效靶比(E1/T2)為4∶1;背景對照組為:E1/T1=0∶1，E2/T2=0∶1;靶細(xì)胞接種濃度每孔為1×104/200μL，接種于儀器配套的E-Plate。每組均設(shè)3個復(fù)孔。靶細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后按比例加入相應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞，檢測靶細(xì)胞CI值(Cell Index)，檢測間隔為10 min，連續(xù)檢測10 h。殺傷效率按下方公式計算得出:

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行配對樣本秩和檢驗分析。統(tǒng)計學(xué)顯著性檢驗為雙側(cè)。

2 結(jié)果

2.1 p CDNA3.1-TCR質(zhì)粒提取

質(zhì)粒濃度1.18 mg/L，A值:1.73。

2.2 體外聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增電轉(zhuǎn)后PBMC特異性TCR基因片段

瓊脂糖凝膠電泳(圖1)可見1 839 bp處有明顯條帶。

圖1 PBMC電轉(zhuǎn)后PCR擴(kuò)增TCRFig 1 Detection of TCR of transfered PBMC by PCR

2.3 流式細(xì)胞檢測電轉(zhuǎn)后PBMC細(xì)胞的表型

電轉(zhuǎn)后細(xì)胞存活率為15% ～20%。電轉(zhuǎn)后12～24 h可見熒光蛋白表達(dá)。電轉(zhuǎn)效率約為15.28%(圖2)。ESO-TCR PBMC中 CD8+T細(xì)胞占 27.6%，CD4+T細(xì)胞占14.5%。檢測ESO-TCR PBMC細(xì)胞表面Vβ13.1表達(dá)率為27.84% ±1.46%，顯著高于空電轉(zhuǎn)PBMC的 2.48% ±0.36%(圖3，P ＜0.05)。

2.4 電轉(zhuǎn)后PBMC分泌IFN-γ的檢測結(jié)果

ELISPOT檢測兩組細(xì)胞分泌IFN-γ情況。實驗組細(xì)胞分泌IFN-γ的斑點數(shù)為(133.20±7.39)，明顯多于空電轉(zhuǎn)組的(4.71±0.82)(p＜0.05)。非特異性對照組斑點數(shù)為(24.80±5.50)，顯著低于實驗組而高于空電轉(zhuǎn)組(p＜0.05)。

2.5 電轉(zhuǎn)后PBMC特異性殺傷實驗結(jié)果

按不同比例加入效應(yīng)細(xì)胞后，培養(yǎng)10 h，效靶比(E/T)為4∶1、2∶1、1∶1、0.5∶1時，實驗組(E1/T1)殺傷效率均明顯高于效靶比為4∶1時非特異對照組(E2/T1)及空電轉(zhuǎn)組(E1/T2)的殺傷效率(圖4，P ＜0.05)。

3 討論

針對NY-ESO-1抗原的過繼性免疫治療目前已進(jìn)入臨床試驗階段。最近有研究者以NY-ESO-1為靶標(biāo)，使用TCR對自體T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾后，用其治療惡性黑色素瘤及滑膜肉瘤患者。實驗結(jié)果顯示接受治療的17名惡性黑色素瘤患者以及10名滑膜肉瘤患者中，各有8名產(chǎn)生了明顯的臨床應(yīng)答，并且實驗過程中未觀察到該治療方法對正常組織產(chǎn)生毒性作用。該臨床試驗研究結(jié)果證明T細(xì)胞介導(dǎo)的以NY-ESO-1作為靶標(biāo)的靶向治療能夠作為一種有效的治療途徑［5］。本實驗前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NY-ESO-1在120例原發(fā)性肝癌患者中表達(dá)率為23.3%，且患者體內(nèi)該抗原的表達(dá)情況與肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)［6］。提高NY-ESO-1陽性肝癌患者體內(nèi)T細(xì)胞別該抗原進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，將有助于降低肝癌患者的復(fù)發(fā)率，延長患者生存期。

本實驗通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)的方式將NY-ESO-1特異性TCR基因電轉(zhuǎn)至正常人PBMC中，顯著提高了NY-ESO-1特異性TCR基因在人PBMC細(xì)胞表面的表達(dá)率。本研究發(fā)現(xiàn):經(jīng)NY-ESO-1b多肽遞呈后，實驗組ESO-TCR PBMC分泌IFN-γ的效率明顯高于空電轉(zhuǎn)組。IFN-γ由CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞分泌，能夠聚集APCs并通過APCs吸引更多的T細(xì)胞，同時上調(diào)腫瘤細(xì)胞及攜帶腫瘤的APCs上MHCⅠ類及Ⅱ類分子的表達(dá)［7］。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生損傷時，IFN-γ能與肝臟非實質(zhì)細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活自身免疫反應(yīng)及過繼性免疫反應(yīng)［8］。IFN-γ可通過促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)細(xì)胞分裂周期停滯兩種途徑抑制肝細(xì)胞過度增殖［9-11］。所以，轉(zhuǎn)導(dǎo)NY-ESO-1特異性TCR至T淋巴細(xì)胞，提高細(xì)胞特異性分泌IFN-γ的效率將有助于抑制NY-ESO-1陽性肝臟腫瘤的生長。

總之，本實驗通過電轉(zhuǎn)方式成功將NY-ESO-1特異性TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入正常人PBMC中，通過特異性抗原肽呈遞提高了外周血淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的效率，同時提高了ESO-TCR PBMC對NY-ESO-1抗原陽性肝癌細(xì)胞的特異性殺傷效率。為今后進(jìn)行TCR基因修飾T細(xì)胞的過繼性免疫治療提供了基礎(chǔ)資料。

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