段 婧，羅 慧，史可鑒，楊 洋，許彩民

(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室北京協(xié)和醫(yī)學院，北京100005)

白血病是一類由于造血干細胞異常引起的克隆性惡性血液疾?。?］。硒是具有抗癌作用的人體必需微量元素之一，大量證據(jù)表明，超營養(yǎng)劑量的硒能夠誘導多種腫瘤細胞的凋亡。亞硒酸鈉是一種潛在的白血病治療藥物，但是硒化合物的抗癌機制，尤其是特異性殺傷腫瘤細胞的分子機制目前尚不清楚。本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉可以通過多條通路誘導白血病細胞凋亡［2－4］。本實驗主要探討AMPK/mTOR通路在這個過程中所起的作用。AMPK是一種異源三聚體蛋白，由一個催化亞基(α)和兩個調(diào)節(jié)亞基(β和γ)3個亞單位組成。本實驗研究AMPKα亞基的蘇氨酸172位磷酸化。AMPK能夠重編程細胞的能量代謝，同時通過mTOR、P53 調(diào)控細胞凋亡與自噬［5－6］。AMPK 作為感受細胞能量的開關(guān)在細胞的代謝調(diào)控中起到十分重要的作用。現(xiàn)代觀點認為腫瘤的發(fā)生與細胞代謝紊亂密切相關(guān)［7］。實驗證據(jù)表明AMPK在許多腫瘤細胞中都是異常激活的［8－9］，它的磷酸化激活可以對細胞能量代謝過程的一些關(guān)鍵蛋白激酶如:mTOR、PI3K及SREBP-1等進行調(diào)控，進而對細胞的凋亡產(chǎn)生影響。本實驗用AMPKα亞基的特異性激活劑AICAR和干擾序列對AMPK及其相關(guān)蛋白mTOR在亞硒酸鈉誘導白血病NB4細胞凋亡的過程中所起的作用進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系:NB4細胞系(中國協(xié)和醫(yī)科大學藥物研究所惠贈)，表達野生型功能性P53基因。

1.1.2 試劑與抗體:亞硒酸鈉(Sigma-Aldrich公司);兔抗人AMPKα抗體、兔抗人p-P70S6K抗體和兔抗人p-mTOR抗體(Cell Signaling Technology公司);辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);DharmaFECT 1轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Scientific公司);AMPKα1/2干擾序列(Santa Cruz公司sc-45312);Annexin V/PI染色試劑盒(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):將NB4細胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清1640培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。實驗時采用處于對數(shù)生長期的細胞，實驗起始濃度為4×105個/mL。

1.2.2 細胞處理:分別采用0、2、5、10和20μmol/L亞硒酸鈉及20μmol/L亞硒酸鈉處理NB4細胞0、3、6、12和24 h，提取細胞總蛋白。激活AMPK時分別采用1 mmol/L的AMPKα亞基的特異激活劑AICAR以及1 mmol/L的AICAR預處理1 h后用20μmol/L的亞硒酸鈉處理NB4細胞;干擾AMPK時分別采用AMPKα1特異的siRNA和siRNA干擾過夜后再用20μmol/L的亞硒酸鈉處理NB4細胞。激活和干擾處理后24 h提取細胞總蛋白，Western blot檢測相關(guān)蛋白以及AnnexinV/PI染色后流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.3 Western blot方法:收集細胞，用預冷PBS洗1次，RIPA裂解液裂解細胞，超聲5 s，每個樣品6次，離心收集上清液即為總蛋白溶液。用Bradford法測量蛋白含量，取等量蛋白進行10%SDS-PAGE電泳，蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，以含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉1 h，一抗孵育4℃過夜。TBST洗膜，用相應的辣根過氧化物酶標記的二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜后ECL顯色發(fā)光檢測相應條帶。β-actin作為內(nèi)參照。所有實驗至少重復3次。

1.2.4 RNA干擾實驗:1 mL無血清無雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基將NB4細胞稀釋成106個/mL鋪到12孔板中37℃，5%CO2預培養(yǎng)。在一個無RNA酶的離心管中用Opti-MEM將siRNA母液配成100μL 50 nmol/L的工作液，在另一個無RNA酶的離心管中用97μL Opti-MEM稀釋3μL的DharmaFECT轉(zhuǎn)染試劑。兩管分別混勻靜置5 min后，將兩管混勻室溫孵育20 min。將配制好的混合液加入含有1 mL Opti-MEM的培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)染6 h后，往培養(yǎng)板中加入新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后用亞硒酸鈉處理，再培養(yǎng)24 h后收集細胞，Western blot檢測蛋白表達。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測凋亡率:約106個細胞經(jīng)過激活或干擾后，收集細胞，1 000×g離心5 min，冰冷PBS洗滌1次。收集約105個細胞用100μL含2μL Annexin V-FITC染料和0.1μL PI染料的Binding緩沖液將細胞懸浮，避光15 min，過篩后上機檢測。

1.2.6 免疫共沉淀:約107個細胞經(jīng)過硒處理24 h后，收集細胞，RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min(r=8.5 cm)離心15 min收集蛋白上清;Bradford法對蛋白定量后，調(diào)蛋白濃度成一致;用相應一抗免疫沉淀目標蛋白，4℃旋轉(zhuǎn)過夜;然后用25μL瓊脂糖珠子捕獲免疫沉淀復合物，4℃反應3 h;RIPA洗滌沉淀復合物3遍，3×SDS loading緩沖液重懸沉淀，煮沸后使蛋白變性;離心收集樣品上清，－80℃保存或進一步用Western blot檢測。

2 結(jié)果

2.1 亞硒酸鈉對NB4細胞中AMPK蛋白磷酸化水平的影響

亞硒酸鈉處理NB4細胞后隨著亞硒酸鈉濃度增加、處理時間延長，AMPK蛋白的磷酸化水平上升(圖1)。

2.2 亞硒酸鈉對NB4細胞中mTOR及P70S6K蛋白磷酸化水平的影響

亞硒酸鈉處理NB4細胞后隨著亞硒酸鈉濃度增加、處理時間延長，mTOR及P70S6K蛋白的磷酸化水平下調(diào)(圖2)。

2.3 激活AMPK對亞硒酸鈉處理后NB4細胞中mTOR、P70S6K磷酸化水平以及細胞凋亡的影響

和對照組相比，亞硒酸鈉、AICAR以及亞硒酸鈉和 AICAR聯(lián)用均能夠明顯激活 AMPK，抑制mTOR以及P70S6K，凋亡相關(guān)分子PARP切割明顯(圖3A)。亞硒酸鈉、AICAR以及亞硒酸鈉和AICAR聯(lián)用處理后細胞的凋亡率相比對照組均有明顯上升(圖3B)。

2.4 干擾AMPK對亞硒酸鈉處理后NB4細胞中mTOR、P70S6K磷酸化水平及細胞凋亡的影響

相比亞硒酸鈉處理組，AMPKα1 siRNA以及亞硒酸鈉和AMPKα1聯(lián)用處理組，mTOR、P70S6K磷酸化水平有顯著上升、凋亡相關(guān)分子PARP切割明顯減弱(圖4A)，AMPKα1 siRNA及亞硒酸鈉和AMPKα1 siRNA聯(lián)用處理后細胞的凋亡率相比亞硒酸鈉處理組均有明顯下降(圖4B)。

圖5 亞硒酸鈉對NB4細胞中AMPK和mTOR相互作用的影響Fig 5 Effect of sodium selenite on interaction between AMPK and mTOR in NB4 leukemia cancer cells

2.5 AMPK和mTOR有相互作用

亞硒酸鈉處理NB4細胞24 h后AMPK和mTOR之間的確存在直接的相互作用(圖5)。

3 討論

硒是一種具有潛在抗癌作用的微量元素。國內(nèi)外研究結(jié)果證明，在某些含硒量高的地區(qū)，癌癥發(fā)病率較低。本實驗前期研究表明，在NB4細胞中亞硒酸鈉通過抑制mTOR可以抑制自噬，進而促進凋亡［10］，動物模型也證明硒可以抑制腫瘤的生長［11］。

AMPK是能量代謝和自噬、凋亡調(diào)控中的重要分子［12］。在細胞內(nèi) AMPK被激活后可對 P53、mTOR等凋亡自噬中的關(guān)鍵調(diào)控分子進行磷酸化，進而對細胞的凋亡自噬進行調(diào)控［13－14］。推測AMPK作為mTOR的上游分子，通過抑制自噬促進了凋亡。

本研究采用不同濃度亞硒酸鈉及不同時間處理NB4細胞后檢測AMPK、mTOR以及P70S6K的磷酸化水平及其在調(diào)控凋亡過程中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著亞硒酸鈉濃度的增大，處理時間的增長，AMPK的磷酸化水平顯著增加，而mTOR以及P70S6K的磷酸化水平顯著降低。用AMPK的激活劑AICAR處理NB4細胞24 h后，能夠顯著激活 AMPK、抑制mTOR以及P70S6K，凋亡相關(guān)分子PARP切割明顯增多;流式細胞結(jié)果也顯示激活AMPK后細胞的凋亡率相比對照組均有明顯上升。AICAR與亞硒酸鈉對NB4細胞的類似影響提示亞硒酸鈉可能通過激活AMPK、抑制mTOR從而促進NB4細胞凋亡。

干擾AMPK后NB4細胞中mTOR以及P70S6K的磷酸化水平相比對照組明顯增加，表明AMPK的確對mTOR存在抑制作用;同時流式細胞分析數(shù)據(jù)表明和亞硒酸鈉處理組相比，干擾AMPK后亞硒酸鈉處理組的凋亡率有顯著下降。以上結(jié)果表明，干擾AMPK可以減弱對mTOR的抑制，拮抗亞硒酸鈉對NB4細胞凋亡的促進作用。

免疫共沉淀實驗證明，AMPK和mTOR之間存在直接相互作用，提示亞硒酸鈉引起的AMPK蘇氨酸172位的磷酸化激活可能對mTOR的活性起到直接的負調(diào)控作用。

綜上研究結(jié)果證明，亞硒酸鈉可激活白血病NB4細胞中AMPKα，進而抑制mTOR以及P70S6K的磷酸化水平，從而促進NB4細胞凋亡，AMPK與mTOR之間的相互作用可能對它們協(xié)同調(diào)控NB4細胞凋亡起到了一定的作用。

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