諶海蘭，王 鵬，黃美容，胥文春

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016;2.河南省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，河南鄭州450003;3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院輸血科，貴州遵義563003)

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)是一種以磷酸吡哆醛為輔基的酶，其在體內(nèi)可逆地催化L-丙氨酸和α-戊二酸轉(zhuǎn)化為L-谷氨酸和L-丙酮酸，通過調(diào)節(jié)這4類物質(zhì)的量而在糖與氨基酸的相互轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。由于ALT在肝臟中的含量較血清中高1 000倍以上，因此肝臟損傷時(shí)血中ALT水平增高顯著，是目前臨床評(píng)價(jià)肝臟功能最靈敏的一個(gè)指標(biāo)。近年來發(fā)現(xiàn)ALT有3種同功酶，ALT1、ALT2 和 ALT2-2［1］。ALT1 與 ALT2 有共同催化活性，而ALT2-2未發(fā)現(xiàn)有催化活性［2］。ALT1主要分布于肝、腎和骨骼肌中;ALT2主要分布在骨骼肌和心肌細(xì)胞中，而在肝臟和腎臟組織中未見表達(dá)［3］，因此血清中ALT1水平比總ALT能更特異的反映肝臟功能狀態(tài)［4-7］。但由于ALT1和ALT2有共同催化活性，所以很難用酶法將二者分別測定，而ALT屬于蛋白質(zhì)，因此首選檢測方法是免疫學(xué)法［8］。

生物信息學(xué)分析［9］發(fā)現(xiàn)，ALT1的N端1～115個(gè)氨基酸序列含有免疫原性較高的兩個(gè)抗原表位，這115個(gè)氨基酸序列與ALT2及ALT2-2全長相似性75%左右，但在生物信息學(xué)分析具有較強(qiáng)免疫原性的2段表位序列，與ALT2及ALT2-2均不存在同源性。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過原核表達(dá)系統(tǒng)制備含ALT1 N端1～115個(gè)氨基酸序列的ALT1截短蛋白并制備其多克隆抗體，為ALT1免疫學(xué)體外診斷試劑的研發(fā)提供原料，為肝臟疾病的診斷和鑒別診斷提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑:DNA純化試劑盒、HindⅢ、NdeⅠ、DNA聚合酶、連接酶(Takara公司);DNA膠回收試劑盒(Invitrogen公司);質(zhì)粒提取試劑盒(Omiga公司);弗氏佐劑(Sigma公司);其他試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為Millipore純凈水。

1.1.2 質(zhì)粒，菌株:pCold TF載體(金斯瑞生物公司)，HRV 3C蛋白酶(本室自制)，大腸桿菌E．Coli BL21(DE3)(本室保存)。

1.1.3 動(dòng)物:清潔級(jí)新西蘭大白兔，體質(zhì)量約2.0 kg，來源于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心并于中心處代養(yǎng)［合格證號(hào)SCXK(渝)2007-0001］。

1.2 方法

1.2.1 截短ALT1原核表達(dá)載體的構(gòu)建:以本研究前期構(gòu)建的含ALT1全長序列的質(zhì)粒PGEX4T-2-ALT1(已經(jīng)過基因測序且序列正確)為模板，采用上游引物:5'-CTGGGTAGACATATGGCCTCGAGCACA GGTGAC-3'(含NdeⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物:5'-CC CCAGCTGAAGCTTCAACACGCCTGCAAGATGCGCT C-3'(含HindⅢ酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增ALT1的N端1～115個(gè)氨基酸編碼序列，加上酶切位點(diǎn)共354 bp。將目的基因片段插入pCold TF載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒PCR、雙酶切鑒定后進(jìn)行DNA測序。

1.2.2 截短 ALT1融合蛋白的表達(dá):重組質(zhì)粒pCold TF-ALT1構(gòu)建成功后，于LB液體培養(yǎng)基中經(jīng)IPTG(終濃度0.5 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)，16℃，16 h。以4℃，8 000 r/m離心收集細(xì)菌，用PBS重懸，超聲破菌:功率200 W，超聲3 s暫停5 s，工作時(shí)間30 min/L菌。4℃，12 000 r/m，離心30 min收集上清，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后用于后續(xù)純化。

1.2.3 截短ALT1融合蛋白的純化:鎳柱親和層析純化重組蛋白后，再經(jīng)HRV 3C蛋白酶切，比例:重組蛋白:HRV3C(w:w)=4～10∶1，4℃酶切過夜。再用鎳離子親和柱去除標(biāo)簽蛋白，收集穿透液，超濾濃縮至濃度大于20 g/L后采用分子篩純化，SDSPAGE分析蛋白純度。

1.2.4 截短ALT1多克隆抗體的制備:免疫前取兔耳緣靜脈血測本底效價(jià)，選取無效價(jià)新西蘭大白兔用于免疫。首次免疫方案:300μg/只，蛋白與等量弗氏完全佐劑乳化后，于腹股溝、背部、皮下多點(diǎn)注射免疫。7 d后，再次免疫，劑量及方法同首次免疫。首次免疫后第28天蛋白與弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫。首次免疫后第35天經(jīng)兔耳緣靜脈取血，間接ELISA檢測抗體效價(jià)，經(jīng)頸動(dòng)脈插管放血，離心分離血清，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 多克隆抗體的純化:兔血清用蛋白A抗體純化柱純化后用ELISA方法測效價(jià)，以SDS-PAGE分析蛋白純度，分裝后-80℃保存。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增

以質(zhì)粒PGEX4T-2-ALT1為模版，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，可見在350 bp左右有一明顯的條帶(圖1)，與預(yù)期基因片段長度相符。

圖1 PCR擴(kuò)增ALT1基因Fig 1 PCR products for ALT1 gene

2.2 重組質(zhì)粒鑒定

2.2.1 菌液PCR:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)抗生素篩選后，挑取8株菌行菌液PCR鑒定。結(jié)果顯示，除8號(hào)菌外均于350 bp處出現(xiàn)明顯的條帶(圖2)，與預(yù)期相符。陰性克隆命名為BL21/pCold TF-ALT1。

圖2 菌液PCR鑒定重組質(zhì)粒Fig 2 Identification of recombinant plasmidsin BL21/pCold TF-ALT1

2.2.2 重組質(zhì)粒雙酶切及DNA測序:重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ、NdeⅠ雙酶切，在約350 bp處可見一酶切片段(圖3)，大小與預(yù)期相符，經(jīng)DNA測序證明序列正確。

圖3 pCold TF-ALT1質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig 3 Identification of pCold TF-ALT1plasmid with enzyme digested

2.3 截短ALT1蛋白表達(dá)及可溶性分析

BL21/pCold TF-ALT1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，以轉(zhuǎn)pCold TF空載(BL21/pCold-TF)做誘導(dǎo)前后對照。重組融合蛋白分子質(zhì)量約70 ku(pCold TF標(biāo)簽蛋白約54 ku，目的蛋白ALT1約16 ku)，結(jié)果顯示上清中存在該蛋白，表明該蛋白為可溶性表達(dá)(圖4)。

圖4 pCold TF-ALT1重組蛋白表達(dá)Fig 4 Recombinant protein from supernatant of BL21/pCold TF-ALT1 analyzed by SDS PAGE

2.4 重組蛋白的純化

2.4.1 截短TF-ALT1融合蛋白鎳柱親和層析純化:重組蛋白大量表達(dá)經(jīng)鎳柱層析純化，得到含標(biāo)簽的重組融合蛋白，約70 ku(圖5)。

2.4.2 HRV 3C酶切融合蛋白:重組融合蛋白TFALT1經(jīng)HRV 3C蛋白酶酶切，得到含無標(biāo)簽截短ALT1蛋白、HRV 3C蛋白酶和TF標(biāo)簽的混合酶切產(chǎn)物(圖6)。2.4.3 分子篩純化無標(biāo)簽ALT1蛋白:融合蛋白去除TF標(biāo)簽蛋白后，再經(jīng)分子篩純化，得到不含標(biāo)簽的截短ALT1純蛋白，純度大于90%(圖7)。經(jīng)多步純化，最后每升菌可獲無標(biāo)簽蛋白5 mg。

2.5 截短ALT1抗血清制備及純化

免疫新西蘭大白兔后，經(jīng)ELISA檢測，其抗血清效價(jià)可達(dá)4×106。采用蛋白A柱純化兔多克隆抗體，經(jīng)SDSPAGE鑒定，可見重鏈于55 ku左右，輕鏈于25 ku左右(圖8)。

2.6 抗血清的鑒定

純化后的抗體經(jīng)Western blot鑒定，與TF標(biāo)簽蛋白、正常人血清無反應(yīng)，與乙型肝炎病患者血清及HepG2人肝癌細(xì)胞裂解液反應(yīng)，與重組表達(dá)的截短ALT1蛋白反應(yīng)(圖9)。

圖9 Western blot鑒定ALT1多克隆抗體特異性Fig 9 Identification of ALT1 polyclonal antibody by Western blot

3 討論

如前言所述，ALT1的質(zhì)量檢測比ALT總酶活性的檢測能更特異的反映肝細(xì)胞損傷，因此免疫學(xué)檢測是今后的發(fā)展方向。

本研究前期通過多次嘗試，擬表達(dá)全長ALT1蛋白，然后制備其多克隆抗體和單克隆抗體。但通過pET32a(+)，pET28a(+)等多種載體均未能表達(dá)出產(chǎn)量高、可溶的全長ALT1蛋白。通過多種B細(xì)胞抗原表位預(yù)測軟件分析，從表面可及性、轉(zhuǎn)角及線性結(jié)構(gòu)、柔韌性、親水性和抗原性等方面篩選免疫原性強(qiáng)的抗原表位，發(fā)現(xiàn)在ALT1的N端1～115個(gè)氨基酸序列內(nèi)包含兩個(gè)易暴露、具空間可及性等免疫原性較強(qiáng)的抗原表位(MASSTGDRSQAVRHG和NPDLLSSPNFPDDAKK)，且這2個(gè)位點(diǎn)氨基酸序列與人和鼠體內(nèi)的蛋白均無較高的同源性。而經(jīng)驗(yàn)表明，直接用肽段免疫難以獲得高效價(jià)和高親和力的抗體。因此用表達(dá)含這2個(gè)表位肽的N端115個(gè)氨基酸，制備其抗體。將該序列DNA片段插入pCold TF載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出大量、可溶的ALT1融合蛋白，經(jīng)HRV 3C蛋白酶酶切，將ALT1蛋白和TF標(biāo)簽蛋白切開，通過二次鎳柱純化和高分辨能力的分子篩純化得到不含標(biāo)簽及其他雜蛋白的截短ALT1純蛋白。

截短ALT1蛋白免疫新西蘭大白兔制備的多克隆抗體可與乙肝病人血清及高分泌ALT的肝癌細(xì)胞HepG2裂解液反應(yīng)，而與正常人血清和標(biāo)簽蛋白無反應(yīng)，表明該血清有較高特異性。本實(shí)驗(yàn)獲得的無標(biāo)簽蛋白作為較純的免疫原，由于沒有分子質(zhì)量較大的標(biāo)簽蛋白形成空間位阻，可以被機(jī)體更好的識(shí)別。

高質(zhì)量的ALT1抗原和特異的多克隆抗體的獲得為ALT1的免疫學(xué)檢測試劑的研發(fā)提供了依據(jù)。

［1］Toshio O，Yutaka S，Tetsuo N，et al.Complete sequencing and characterization of 21，243 full-length human cDNAs［J］.Nature Genetics，2004，36:40-45.

［2］Glinghammar B，Rafter I，Lindstrom A，et al.Detection of the mitochondrial and catalytically active alanine aminotransferase in human tissues and plasma［J］.Int J Mol Med，2009，23:621-631.

［3］Lindblom P，Rafter I，Copley C，et al.Isoforms of alanine aminotransferases in human tissues and serum-differential tissue expression using novel antibodies［J］.Arch Biochem Biophys，2007，466:66-77.

［4］Josef O，Marcia R，Martin S，et al.The current state of serum biomarkers of hepatotoxicity［J］.Toxicology，2008，245:194-205.

［5］ Georgina PR，Cristina A，Laura OL，et al.Paralogous ALT1 and ALT2 retention and diversification have generated catalytically active and inactive aminotransferases in saccharomyces cerevisiae［J］.PLoS One，2012，7:e45702.doi:10.1371/journal.pone.0045702.

［6］Yang RZ，Park S，Reagan WJ，et al.Alanine aminotransferase isoenzymes:molecular cloning and quantitative analysis of tissue expression in rats and serum elevation in liver toxicity［J］.Hepatology，2009，2，49:598-607.

［7］Rafter I，Gr?berg T，Kotronen A，et al.Isoform-specific alanine aminotransferase measurement can distinguish hepatic from extrahepatic injury in humans［J］.Int J Mol Med，2012，11，30:1241-1249.

［8］Li Liu，Shao Zhong，Rongze Yang，et al.Expression，purification，and initial characterization of human alanine aminotransferase(ALT)isoenzyme 1 and 2 in High-five insect cells［J］.Protein Expr Purifi，2008，8，60:225-231.

［9］張維銘.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊［M］.2版.北京:科學(xué)出版社，2003:412-477.