莊 穎，魯玲玲，趙春禮，段春禮，楊 慧

(首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系北京腦重大疾病研究院北京市神經(jīng)再生修復(fù)研究重點實驗室神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京100069)

帕金森病(Parkinson's Disease，PD)其主要病理特征為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)以聚集化的 α-突觸核蛋白(α-syuclein，α-syn)為主要成分的路易小體［1］，并伴隨以小膠質(zhì)細胞激活為主要特征的免疫炎性反應(yīng)［2－4］，但此類炎性反應(yīng)的具體機制目前還不清楚。

α-syn 是第一個被發(fā)現(xiàn)的 PD 致病基因［5－6］。在小膠質(zhì)細胞系BV2細胞中過表達野生型α-syn可致炎癥因子 TNF-α，NO 等釋放量顯著增高［7－8］，但其確切分子機制目前尚無報道。

Nurr1作為核受體超家族的一種轉(zhuǎn)錄因子與PD密切相關(guān)［10］。近年來，Saijo等發(fā)現(xiàn)用LPS刺激小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎性因子后致Nurr1上調(diào)，其入核后作為轉(zhuǎn)錄抑制子使炎性因子無法轉(zhuǎn)錄，當(dāng)敲減掉Nurr1后可促進炎性反應(yīng)的發(fā)生［9］。

因此，本研究觀察α-syn是否通過Nurr1調(diào)節(jié)炎性因子TNF-α產(chǎn)生，為闡明PD可能發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞:人源的神經(jīng)母細胞瘤細胞系(SK-N-SH)，(ATCC公司);小鼠小膠質(zhì)細胞系(BV2)，由首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系王曉民教授惠贈;Wizard Plus Midipreps DNA Purification systems(Promega公司);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(Gibco公司);RIPA裂解液(北京普利萊基因有限公司);蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(Merck公司);Elisa試劑盒(R＆D公司);胞質(zhì)胞核分離提取試劑盒(Millipore公司);anti-MYC 抗體、anti-β-actin(Sigma-aldrich公司);Histon抗體(CST公司);α-syn抗體(BD公司);Nurr1抗體(Santa公司);OX-6抗體(Abcam公司);人源α-syn慢病毒載體:LV-GFP-αsyn(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司);人源α-syn質(zhì)粒(pCMV-MYC-α-syn)和人源Nurr1質(zhì)粒(pAAVNurr1)均由本實驗室成功構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:SK-N-SH細胞，BV2細胞采用含10%的胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基，置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照lipofectamine2000操作說明書進行。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色:將攜帶有GFP標(biāo)簽的αsyn慢病毒感染的BV2細胞傳代于24孔板，棄掉培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，加入4%多聚甲醛，室溫固定20 min，PBST室溫沖洗3次，8%山羊血清室溫孵育1 h，加入anti-myc(1∶1 000)、anti-OX-6(1∶1 000)和 anti-Nurr1(1∶100)一抗，4℃過夜，次日用PBST洗3次，加入相應(yīng)的熒光二抗(1∶500)，37℃避光孵育1 h，PBST洗3次，加入DAPI于37℃避光孵育5 min復(fù)染細胞核，PBST沖洗3次，甘油封片后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-IP):質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24 h收集SK-N-SH細胞，進行細胞裂解，留取少量作免疫印跡對照，其余上清用于免疫共沉淀實驗。每個樣品加入10 μL相應(yīng)抗體(α-syn，Nurr1，IgG)及1 mL Co-IP緩沖液，加入IgG組作為空白對照，置于4℃旋轉(zhuǎn)孵育12 h后均加入Protein G agarose beads，于4℃輕輕旋轉(zhuǎn)12 h，洗滌緩沖液漂洗后加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液，95℃加熱5 min，然后離心取上清，進行Western blot分析。

1.2.4 蛋白印跡(Western blot):BCA法測蛋白濃度，SDSPAGE電泳，半濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，8% 脫脂牛奶封閉1 h，分別入 α-syn(1∶500)、Nurr1(1∶100)、β-actin(1∶1 000)一抗，4 ℃ 過夜。0.1%TBST洗膜3次，入相應(yīng)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔/鼠免疫球蛋白抗體中(1∶10 000)，室溫孵育1 h，洗膜同前。加入化學(xué)發(fā)光液，于暗室化學(xué)發(fā)光及顯影、定影。

1.2.5 胞質(zhì)胞核的分離提取:用α-syn慢病毒感染BV2細胞24 h，用胞質(zhì)胞核分離提取試劑盒進行胞質(zhì)胞核蛋白分離提取(按照試劑盒說明書)，進行Western blot檢測。

1.2.6 Elisa試劑盒檢測:轉(zhuǎn)染 Myc-vector，pCMVMYC-synuclein，pAAV-Nurr1質(zhì)粒于BV2細胞24 h后，分別取細胞上清，離心去除雜質(zhì)，立即進行檢測(按照試劑盒說明書)，剩余樣品分裝后放于－20℃儲存。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均通過SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)檢驗，以均數(shù)±標(biāo)準差)表示。

2 結(jié)果

2.1 α-syn和Nurr1存在亞細胞共定位

α-syn與Nurr1在BV2細胞中存在共定位關(guān)系(圖1)。

2.2 α-syn和Nurr1可能存在相互作用

用Nurr1抗體可以免疫沉淀α-syn蛋白(圖2A)。用α-syn抗體可以免疫沉淀Nurr1蛋白(圖2B)，而在上述實驗的空載體對照組則沒有沉淀到相應(yīng)蛋白。

2.3 過表達α-syn可抑制Nurr1核轉(zhuǎn)位

用攜帶GFP標(biāo)簽的α-syn慢病毒成功感染B V2細胞后 (圖3A)，可以觀察到BV2細胞激活即小膠質(zhì)細胞激活的特異性標(biāo)志OX-6產(chǎn)生增多，Nurr1的核轉(zhuǎn)位減少 (圖3B)。提取胞質(zhì)胞核蛋白進行Western blot分析，在過表達 α-syn組胞核中的Nurr1與正常組和對照組相比明顯減少 (圖3C)。

圖3 過表達α-syn后對BV2中Nurr1核轉(zhuǎn)位的影響Fig 3 The influence ofα-syn overexpression on Nurr1 nuclear translocation in BV2 cells(×160)

2.4 過表達α-syn和Nurr1明顯影響TNF-α的產(chǎn)生

在BV2細胞中單獨過表達α-syn可使TNF-α產(chǎn)生顯著增多(p＜0.05)，而共表達α-syn與Nurr1可顯著減少TNF-α的產(chǎn)生 (p＜0.05)(圖4)。

圖4 過表達α-syn和Nurr1后對于BV2細胞TNF-α釋放的影響Fig 4 The influence ofα-syn-，Nurr1-or doubleoverexpression on TNF-αrelease in BV2 cells

3 討論

α-syn使得小膠質(zhì)細胞過度激活產(chǎn)生炎性因子致多巴胺能神經(jīng)元的損傷可能在PD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。但α-syn是如何使小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，目前尚不明確。本研究利用BV2細胞進行免疫熒光標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)α-syn和Nurr1存在共定位，說明二者具有發(fā)生相互作用的生物學(xué)基礎(chǔ)。同時蛋白質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示α-syn和Nurr1存在于一個蛋白質(zhì)復(fù)合體中，推測α-syn可能是通過與Nurr1發(fā)生相互作用，從而影響了Nurr1對于TNF-α產(chǎn)生的抑制。

在以前的研究中Fan等人發(fā)現(xiàn)在原代小膠質(zhì)細胞中在LPS的刺激下，Nurr1會從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞核［5］，而本實驗中在過表達α-syn的 BV2細胞中Nurr1的核轉(zhuǎn)位減少，這說明LPS與α-syn導(dǎo)致的小膠質(zhì)細胞激活機制有可能是不同的。LPS作為一種外來抗原可以引起機體強烈的免疫炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致Nurr1入核增多來抑制炎性因子產(chǎn)生，所以LPS導(dǎo)致的炎性反應(yīng)雖然快速劇烈但可逐步緩解。而α-syn導(dǎo)致的免疫炎性反應(yīng)雖然較LPS緩和卻是進行性加重的，這可能是因為α-syn與Nurr1發(fā)生了相互作用從而使得Nurr1入核減少，使Nurr1對于炎性因子的轉(zhuǎn)錄抑制作用減弱，導(dǎo)致炎性反應(yīng)逐步加劇，但其具體的機制還要在以后的研究中進一步探討。

本研究通過Elisa發(fā)現(xiàn)單獨過表達α-syn可以使小膠質(zhì)細胞炎性因子TNF-α產(chǎn)生增加，當(dāng)同時過表達α-syn和Nurr1后TNF-α的產(chǎn)生有明顯減少，說明Nurr1在一定程度上參與了α-syn所致炎性因子的產(chǎn)生。之前有報道發(fā)現(xiàn)在敲減Nurr1的BV2細胞中，加入LPS刺激后其炎癥程度與正常BV2細胞相比明顯增強［9］，本實驗發(fā)現(xiàn)過表達Nurr1后α-syn導(dǎo)致的炎性反應(yīng)有所減輕，二者結(jié)果相一致。那么α-syn可能是通過與Nurr1發(fā)生相互作用，從而改變了Nurr1的活性，使其入核減少，繼而導(dǎo)致了TNF-α的轉(zhuǎn)錄無法得到抑制，使得炎性反應(yīng)加劇。本研究通過證明α-syn和Nurr1之間的相互作用為我們理解α-syn引發(fā)小膠質(zhì)細胞激活及其引發(fā)的免疫炎性反應(yīng)在PD發(fā)病中的作用提供了一定的線索，但其具體機制尚需進一步研究。

［1］Halliday GM，McCann H．Human-based studies onα-syuclein deposition and relationship to Parkinson＇s diease symptoms［J］．Exp Neurol，2008，209:12 －31．

［2］Matthew K，Berg DA．Microglia activation during neuroregeneration in the adult vertebrate brain ［J］．Neurosci Lett，2011，497:11－16．

［3］Thanh GT，Heckbert SR，Longstreth WT，et al．Nonsteroidal Anti-inflammatory drugs and risk of Parkinson＇s disease［J］．Mov Disord，2006，217:964－969．

［4］Fernagut PO，Chesselet MF．Alpha-synuclein and transgen-ic mouse models［J］．Neurobiol Dis，2004，17:123 －130．

［5］Fan XL，Luo GR，Ming M，et al．Nurr1 expression and its modulation in microglia［J］．Neuroimmunomodulat，2009，16:162－170．

［6］Austin SA，F(xiàn)loden AM，Murphy EJ，et al．α-syuclein expression modulates microglia activation phenotype［J］．J Neurosci，2006，26:10558 －10563．

［7］Rojanathammanee L，Murphy EJ，Combs CK．Expression of mutant alpha-synuclein modulates microglia phenotype in vitro［J］．J Neuroinflammation，2011，8:44 －55．

［8］Austin SA，Rojanathammanee L，Golovko MY，et al．Lack of alpha-synuclein modulates microglial phenotype in vitro［J］．Neurochem，2011，36:994－1004．

［9］ Saijo K，Winner B，Carson CT，et al．A Nurr1/Corest pathway in microglia and astrocytes protects dopaminergic Neurons from inflammation-induced death ［J］． Cell，2009，137:47－59．

［10］Jankovic J，chen S，Le WD．The role of Nurr1 in the development of dopaminergic neurons and Parkinson＇s disease［J］．Prog Neurobiol，2005，77:128－138．