王小蓉，郭正光，高友鶴

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生理與病理生理系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100005)

Ligand of Numb protein X 1(LNX1)蛋白是LNX泛素連接酶家族的4個(gè)成員之一，其N末端有一個(gè)催化RING結(jié)構(gòu)域，C末端串聯(lián)4個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域。最初的研究發(fā)現(xiàn)LNX1作為一個(gè)RING類的泛素連接酶，催化NUMB的泛素化并導(dǎo)致其被蛋白酶體降解［1］。其后，Claudin1、Claudin2、Claudin4［2］、c-src［3］和CD8α［4］也被鑒定是LNX1的底物。除了作為泛素連接酶催化底物泛素化的功能外，LNX1還被報(bào)道通過它的1個(gè)或多個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域與許多細(xì)胞內(nèi)重要蛋白相互作用，如 c-src［3］、Claudins［2］、RhoC［5］、KCNA4［6］、PAK6［6］、PLEKHG5［6］、PKC-alpha1［6］、TYK2［6］、PDZ-binding kinase(PBK)［6］和 CD8α［4］等。LNX1參與多種信號(hào)通路［1－2］，還與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［3，7］。

PBK是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［8］，在腫瘤的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮作用［9－12］。PBK的C末端具有PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合模體(motif)。本實(shí)驗(yàn)以前的研究利用酵母雙雜交體系發(fā)現(xiàn)LNX1PDZ1結(jié)構(gòu)域結(jié)合PBK的C末端序列，另一個(gè)實(shí)驗(yàn)也用免疫共沉淀證實(shí)PBK和LNX1在細(xì)胞內(nèi)相互作用［6］。

在實(shí)驗(yàn)中，一系列重組人LNX1截?cái)囿w蛋白和LNX1全長蛋白被分別克隆、表達(dá)和純化，在體外泛素化體系中研究了其對(duì)PBK的泛素化;進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)研究了LNX1對(duì)PBK的泛素化和降解，為深入研究LNX1的功能提供了重要線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、DNA模板、菌種和細(xì)胞:LNX1的PCR模板 IMAGE克隆(IMAGE:4995278)和 PBK的PCR模板IMAGE克隆(IMAGE:4082846)(Proteintech Group公司)。

原核表達(dá)質(zhì)粒載體PGEX-4T-1和PET-41a+為本實(shí)驗(yàn)室保存。真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA4/MYC-his為本實(shí)驗(yàn)室保存。pcDNA6由醫(yī)科院基礎(chǔ)所強(qiáng)伯勤教授課題組提供。HA-ubiquitin載體由首都醫(yī)科大學(xué)李匯華教授惠贈(zèng)。

大腸桿菌菌株BL21和BL21(DE3)(全式金公司)。HEK293ET細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑、抗體和酶:GSTrap FF(1 mL)(GE Healthcare公司)。MagExtractor(His-tag)(TOYOBO公司)。

E1(Calbiochem公司)，E2(重組UbcH5b蛋白)(UpState公司)。His-ubiquitin(Sigma-Aldrich公司)。

轉(zhuǎn)染試劑MegaTran 1.0 Transfection Reagent(OriGene 公司)。protein G-agarose beads，MG132(Beyotime公司)。RIPA lysis buffer(Applygen公司)。

抗體:anti-S-tag(Abcam公司);anti-Flag-tag(DYKDDDDK)，anti-beta-Tubulin(Abmart公司);anti-MYC-tag(MBL公司);anti-HA-tag(Imagen BioSciences公司)。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建:

1)原核表達(dá)載體的構(gòu)建:分別設(shè)計(jì)引物，以IMAGE克隆(IMAGE:4995278)為模板，將 LNX1全長、LNX1ΔPDZ4(1～600aa)、LNX1ΔPDZ34(1 ～ 497aa)、LNX1ΔPDZ234(1～377aa)和 LNX1ΔPDZ1234(1～273aa)PCR擴(kuò)增出來，PCR產(chǎn)物用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，連接到PGEX-4T-1載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，挑取單克隆，PCR鑒定，最后送交公司測序確定編碼序列和讀碼框架無誤。所有LNX1及其截?cái)囿wN末端融合GST標(biāo)簽。

將編碼PBK蛋白C末端8個(gè)氨基酸殘基(-VEALETDV)的寡聚核苷酸鏈化學(xué)合成，克隆到PET41a+載體的 C末端(酶切位點(diǎn)HindⅢ和XhoⅠ)，作為人工底物的表達(dá)載體。編碼PBK蛋白C末端的人工底物的N末端融合S-tag和His-tag標(biāo)簽。

2)真核表達(dá)載體的構(gòu)建:設(shè)計(jì)引物，以IMAGE克隆(IMAGE:4995278)為模板，將LNX1全長PCR擴(kuò)增出來，PCR產(chǎn)物用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切，連接到 pcDNA4/MYC-His載體上;設(shè)計(jì)引物，以IMAGE克隆(IMAGE:4082846)為模板，將PBK全長PCR擴(kuò)增出來，PCR產(chǎn)物用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切，連接到pcDNA6載體上。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，挑取單克隆，PCR鑒定，最后送交公司測序確定編碼序列和讀碼框架無誤。LNX1真核表達(dá)載體的C末端融合MYC-His標(biāo)簽;PBK真核表達(dá)載體的N末端融合Flag標(biāo)簽。

1.2.2 重組LNX1和人工底物的表達(dá)和純化:GSTLNX1的表達(dá)和純化:分別將測序正確的LNX1全長、LNX1ΔPDZ4、LNX1ΔPDZ34、LNX1ΔPDZ234、LNX1ΔPDZ1234和 PGEX4T-1空載體轉(zhuǎn)化到 BL21感受態(tài)細(xì)胞中，分別挑取單克隆，搖菌擴(kuò)增至 A value=0.8左右，分別加入0.1 mmol/L IPTG 16～26℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)過夜，收集細(xì)胞，超聲破碎，離心去沉淀，上清液用GSTrap FF純化表達(dá)蛋白，SDSPAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色分析蛋白純化效果;純化的蛋白用Bradford法定量。

人工底物表達(dá)和純化:將人工底物轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，搖菌擴(kuò)增至A value=0.8左右，加入0.2 mmol/L IPTG 30℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)4～6 h，收集細(xì)胞，超聲破碎，離心去沉淀，菌體上清液用Mag Extractor(His-tag)試劑盒富集表達(dá)蛋白。

1.2.3 體外泛素化實(shí)驗(yàn):體外泛素化體系包括以下成分:0.1μg E1(Calbiochem)，0.5μg E2(重組UbcH5b)(UpState)，1μg E3(純化的不同截?cái)囿w的LNX1 蛋白)，2 mmol/L ATP，3 μg His-ubiquitin(Sigma-Aldrich)， 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，2.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT，100 ng底物，反應(yīng)體系用去離子水補(bǔ)齊至20μL。在30℃反應(yīng)90 min后，用5×SDS(十二烷基硫酸鈉)上樣緩沖液終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物95℃處理5 min，反應(yīng)混合物用SDS-PAGE分離，用anti-S-tag抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡分析。泛素化的底物和未泛素化的底物分別用Image J定量并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化比值。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)泛素化和降解實(shí)驗(yàn):真核表達(dá)質(zhì)粒用MegaTran 1.0轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至HEK293ET細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24～48 h收獲細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解(含2 mmol/L PMSF)，離心去沉淀。細(xì)胞裂解液上清中加入相應(yīng)的抗體，4℃孵育過夜。免疫復(fù)合物結(jié)合到protein G瓊脂糖凝膠珠孵育1～3 h，瓊脂糖凝膠珠用冷PBS洗3次，加入5×SDS(十二烷基硫酸鈉)上樣緩沖液，95℃處理10 min。處理后的蛋白樣品用SDS-PAGE分離，用相應(yīng)的抗體免疫印跡分析。免疫沉淀下的泛素化蛋白和PBK分別用Image J定量并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化比值。在檢測蛋白降解的實(shí)驗(yàn)中，澄清的細(xì)胞裂解液直接通過SDS-PAGE分離，用相應(yīng)的抗體免疫印跡。在需要蛋白酶體抑制劑的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在收獲前用10μmol/L的MG132處理10～22 h。PBK和內(nèi)參分別用Image J定量并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化比值。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)表達(dá)的純化

純化重組LNX1蛋白和其截?cái)囿w的結(jié)果如圖1所示，純化后的 GST-LNX1ΔPDZ1234、GST-LNX1ΔPDZ234、GSTLNX1ΔPDZ34、GST-LNX1ΔPDZ4 和 GST-LNX1 蛋白分子量分別為 55、70、100、115 和約130 kd，均與理論分子量接近。

圖1 純化后的LNX1截?cái)囿w和LNX1全長蛋白Fig 1 Purification of the LNX1 truncations for the in vitro ubiquitination assays

2.2 體外泛素化實(shí)驗(yàn)

PBK在本實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)證實(shí)是LNX1PDZ1的配體蛋白。在體外泛素中，相對(duì)于LNX1ΔPDZ1234，含有PDZ1的LNX1ΔPDZ234可以顯著地促進(jìn)含有PBK的C末端的人工底物泛素化(圖2)。含有PDZ1的所有 LNX1截?cái)囿w和 LNX1全長都能使PBK的人工底物泛素化。只含有 PDZ1的LNX1ΔPDZ234對(duì)PBK的泛素化最強(qiáng)，而含有更多PDZ的LNX1截?cái)囿w和LNX1全長對(duì)PBK的泛素化程度相對(duì)減弱。

2.3 細(xì)胞內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)

在體外泛素化實(shí)驗(yàn)中，LNX1通過識(shí)別PBK的C末端促進(jìn)其泛素化。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，相對(duì)于單獨(dú)表達(dá)LNX1和PBK，共表達(dá)LNX1和PBK后，PBK在高分子區(qū)段產(chǎn)生更明顯的泛素化鏈(圖3)。

2.4 LNX1促進(jìn)蛋白酶體降解PBK

細(xì)胞內(nèi)蛋白的泛素化通常導(dǎo)致其被蛋白酶體降解［1］。在HEK293ET細(xì)胞中，LNX1的過表達(dá)顯著導(dǎo)致外源轉(zhuǎn)染的PBK的降解，當(dāng)細(xì)胞用10μmol/L的蛋白酶體抑制劑MG132處理22 h后，PBK的降解被明顯地抑制(圖4)。

圖4 LNX1促進(jìn)外源轉(zhuǎn)染的PBK通過蛋白酶體途徑降解Fig 4 LNX1 promotes the proteosomal degradation of exogenous PBK

3 討論

這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)利用體外泛素化體系和哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系發(fā)現(xiàn)了LNX1泛素化PBK并導(dǎo)致外源轉(zhuǎn)染的PBK被蛋白酶體降解。在體外泛素化的實(shí)驗(yàn)中，所有含有PDZ1結(jié)構(gòu)域的LNX1截?cái)囿w都能夠泛素化含有PBK的C末端的人工底物。這一結(jié)果說明LNX1通過PDZ1識(shí)別PBK的C末端并促進(jìn)其泛素化。而含有更多 PDZ結(jié)構(gòu)域的 LNX1ΔPDZ34、LNX1ΔPDZ4和LNX1全長對(duì)PBK的泛素化程度反而降低，這可能是由于LNX1其他PDZ結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生了空間位阻效應(yīng)，阻礙了其與底物通過LNX1PDZ1的相互識(shí)別。通過實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，不含有任何PDZ的LNX1ΔPDZ1234也能夠使PBK人工底物微弱泛素化，其可能原因是，LNX1ΔPDZ1234含有催化結(jié)構(gòu)域RING，由于體外泛素化體系濃度較高，LNX1ΔPDZ1234與人工底物彼此靠近，雖不通過PDZ與C末端相互作用，也能部分地發(fā)生泛素化反應(yīng)。然而含有PDZ結(jié)構(gòu)域的LNX1截?cái)囿w對(duì)上述人工底物的泛素化程度更強(qiáng)，這仍能夠說明PDZ結(jié)構(gòu)域參與了對(duì)底物的識(shí)別。

LNX1已報(bào)道的主要功能是做為E3泛素化底物或作為分子支架將多種蛋白結(jié)合在一起，參與不同的生物學(xué)過程。如LNX1參與調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路［1］;參與細(xì)胞緊密連接的重組［2］;參與 AP-1 信號(hào)傳導(dǎo)過程［5］。在 LNX1 knock down 的細(xì)胞中，β-catenin、MAPK、NF-κB 和 C-MYC 信號(hào)通路被激活，P53和TGF-β依賴的信號(hào)通路被抑制，細(xì)胞周期被阻斷在 G0/G1期［13］。LNX1還與腫瘤的發(fā)生有關(guān)［3，7］。LNX1的更多底物和更多功能仍需進(jìn)一步研究。

上述實(shí)驗(yàn)鑒定了PBK是LNX1的潛在底物。PBK是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［8］，在多種腫瘤的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮作用［9－12］。已有報(bào)道PBK可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活，抵抗化療藥物(如阿霉素)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［9－10］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，LNX1可能通過泛素化和降解腫瘤相關(guān)蛋白PBK，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和凋亡，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生。這需要更多的深入研究來證實(shí)，如RNAi、細(xì)胞生長曲線和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)等。這項(xiàng)研究工作為進(jìn)一步全面系統(tǒng)深入地研究LNX1的功能奠定基礎(chǔ)。

［1］Nie J，McGill MA，Dermer M，et al．LNX functions as a RING type E3 ubiquitin ligase that targets the cell fate determinant Numb for ubiquitin-dependent degradation［J］．EMBO J，2002，21:93 －102．

［2］Takahashi S，Iwamoto N，Sasaki H，et al．The E3 ubiquitin ligase LNX1p80 promotes the removal of claudins from tight junctions in MDCK cells［J］．J Cell Sci，2009，122:985－994．

［3］Weiss A，Baumgartner M，Radziwill G，et al．c-src is a PDZ interaction partner and substrate of the E3 ubiquitin ligase Ligand-of-Numb protein X1［J］．FEBS Lett，2007，581:5131－5136．

［4］D Agostino M，Tornillo G，Caporaso MG，et al．Ligand of Numb proteins LNX1p80 and LNX2 interact with the human glycoprotein CD8alpha and promote its ubiquitylation and endocytosis［J］．JCell Sci，2011，124:3545 －3556．

［5］Zheng D，Sun Y，Gu S，et al．LNX(Ligand of Numb-protein X)interacts with RhoC，both of which regulate AP-1-mediated transcriptional activation［J］．Mol Biol Rep，2010，37:2431－2437．

［6］Wolting CD，Griffiths EK，Sarao R，et al．Biochemical and computational analysis of LNX1 interacting proteins［J］．PLoSOne，2011，6:e26248．

［7］Chen J，Xu J，Zhao W，et al．Characterization of human LNX，a novel ligand of Numb protein X that is downregulated in human gliomas［J］．Int J Biochem Cell Biol，2005，37:2273－2283．

［8］Gaudet S，Branton D，Lue RA．Characterization of PDZ-binding kinase，a mitotic kinase［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2000，97:5167－5172．

［9］Park JH，Lin ML，Nishidate T，et al．PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase，a putative cancer/testis antigen with an oncogenic activity in breast cancer［J］．Cancer Res，2006，66:9186－9195．

［10］Ayllon V，O＇Connor R．PBK/TOPK promotes tumour cell proliferation through p38 MAPK activity and regulation of the DNA damage response［J］．Oncogene，2007，26:3451－3461．

［11］Oh SM，Zhu F，Cho YY，et al．T-lymphokine-activated killer cell-originated protein kinase functions as a positive regulator of c-Jun-NH2-kinase 1 signaling and H-Ras-induced cell transformation［J］．Cancer Res，2007，67:5186－5194．

［12］Zhu F，Zykova TA，Kang BS，et al．Bidirectional signals transduced by TOPK-ERK interaction increase tumorigenesis of HCT116 colorectal cancer cells［J］．Gastroenterology，2007，133:219－231．

［13］Zheng D，Gu S，Li Y，et al．A global genomic view on LNX siRNA-mediated cell cycle arrest［J］．Mol Biol Rep，2011，38:2771－2783．