劉 丹，廖順花，王莉新，王 易

(上海中醫(yī)藥大學免疫學與病原生物學教研室，上海 201203)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)的致病性與其分泌的多種毒力因子有關(guān)，包括:尿素酶(Ure)、鞭毛蛋白(Fla)、細胞毒素相關(guān)蛋白A(cytotoxin associated gene A，CagA)和空泡毒素A(vacuolating cytotoxin，VacA)等。其中VacA是一種單獨作用即可引起靶細胞發(fā)生空泡化、凋亡、骨架重排等病理改變，最終導致宿主細胞死亡的毒性蛋白，與胃、十二指腸的炎癥性疾病密切相關(guān)［1］。已有資料顯示并非全部的H.pylori都具有致病性，那些缺乏毒力因子(如VacA和CagA等)的細胞株常常是低毒株或無毒株，而不具有致病性［2］。且有文獻報道，經(jīng)藥物治療的H.pylori感染人群，其食管癌發(fā)病率增高(源于返流性食管炎的增加)，提示非致病的H.pylori可能是人體潛在的正常菌群，完全清除并非善策［3－4］。故尋找非抗生素的其他治療策略或成為必要。

檳榔、大腹皮是臨床治療慢性活動性胃炎、消化性潰瘍等消化道疾?。?］的常用中藥。氫溴酸檳榔堿(arecoline hydrobromide，AH)是此兩味中藥的主要藥理成分［6］。臨床使用雖不能獲得類似西藥二聯(lián)、三聯(lián)和四聯(lián)等方案聯(lián)合使用的根除效果。但對癥狀的緩解與改善卻十分肯定［7］。為解釋這一現(xiàn)象。本研究提出了中藥在非殺菌劑量下，可能通過抑制H.pylori毒力因子的形成與分泌來下調(diào)其毒性效應的設(shè)想，故選擇VacA作為所選中藥成分氫溴酸檳榔堿的主要實驗對象，在體外實驗予以驗證。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞株及中藥 H.pylori國際標準菌株NCTC11637購自于上海消化疾病研究所。胃癌細胞株BGC-823由上海中醫(yī)藥大學中藥學院贈送。中藥活性成分氫溴酸檳榔堿購自Sigma公司。

1.2 培養(yǎng)基 混合抗生素:多粘菌素B(polymyxin B Sulfate)(Amerisco)2.5 ×107U· L－1，兩性霉素B(Amphotericin B)(Amerisco)5 g· L－1，萬古霉素(Vancomycin HCl)(Amerisco)10 g· L－1，磺胺增效劑(上海日初)5 g· L－1?；旌峡股靥砑佑谂囵B(yǎng)基中，用于抑制其它雜菌的污染，同時可為H.pylori生長提供所需的胸腺嘧啶脫氧核苷［8］。

哥倫比亞固體培養(yǎng)基:哥倫比亞瓊脂(Columbia Agar Base，CAB)(上海日初)39 g· L－1，1‰ (V/V)混合抗生素，10%(V/V)脫纖維羊血(上海青陽)。腦心浸液液體培養(yǎng)基:腦心浸液培養(yǎng)基(上海日初)39 g· L－1，1‰ (V/V)混合抗生素。

1.3 H.pylori的培養(yǎng)和鑒定 H.pylori菌株的固體培養(yǎng):將菌株接種于上述哥倫比亞瓊脂固體培養(yǎng)基上，L型棒均勻涂布，透明膠帶固定后放于充氣罐內(nèi)充入混合氣體(85%N2、10%CO2、5%O2)，37℃恒溫培養(yǎng)，更換氣體每天1次，3～5 d后進行菌種鑒定。取對數(shù)期細菌，經(jīng)無菌 PBS洗滌后，測其OD600nm值，1OD 細菌濃度相當于 1 ×1011· L－1，調(diào)細菌濃度為1×109· L－1，用于后續(xù)實驗。

H.pylori菌株的液體培養(yǎng):刮取已培養(yǎng)48 h的H.pylori菌苔，混懸于1 ml無菌生理鹽水，吸取200 μl接種于4 ml含混合抗生素的腦心浸液液體培養(yǎng)基中，置入?yún)捬豕蓿淙牖旌蠚怏w，37℃ 100 r·min－1振蕩培養(yǎng)，每天更換氣體1次，待液體混濁后進行鑒定。通過形態(tài)學和生化學方法加以鑒定，將具有典型菌落特征者進行涂片和革蘭染色，油鏡觀察其典型形態(tài)特征，并進行快速尿素酶試驗、過氧化氫試驗、氧化酶試驗等一系列生化學鑒定。

1.4 中藥活性成分對 H.pylori最低抑菌濃度(MIC)的測定［9］

1.4.1 固體法 將50 g· L－1氫溴酸檳榔堿倍比稀釋成不同的濃度梯度，每濃度取1 ml于無菌培養(yǎng)皿中，再加入9 ml哥倫比亞瓊脂，使氫溴酸檳榔堿的終濃度為 5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08 g·L－1。取50 μl上述對數(shù)期的 H.pylori菌液接種于制備好的含藥固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3～5 d后觀察細菌的生長情況，每個濃度做3復板，無細菌生長的最小藥物濃度為MIC。

1.4.2 液體法 使用含混合抗生素的腦心浸液液體培養(yǎng)基對氫溴酸檳榔堿進行倍比稀釋，使藥液終濃度與固體法一致，每個濃度做3復管，加入對數(shù)期菌液 100 μl，培養(yǎng)3 ～4 d 后，每管各取50 μl接種于不含中藥活性成分的哥倫比亞瓊脂固體培養(yǎng)基上，無細菌生長的最小濃度為MIC。

1.5 粗制VacA蛋白制備 將對數(shù)期細菌分別培養(yǎng)于含有0.15 g· L－1溴酸檳榔堿的液體培養(yǎng)基中，并設(shè)立不加藥物處理的對照組，每組3復管，培養(yǎng)至液體渾濁 (OD600=0.8)后，收集各組細菌菌液，按照文獻方法進行粗制VacA蛋白制備［10］，測蛋白濃度，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 VacA活性檢測 胃癌細胞BGC-823作為H.pylori分泌的VacA毒性作用的靶細胞，在本研究中用來評價VacA的細胞毒性效應。BGC-823培養(yǎng)于含10%新生牛血清(Gibco)的RPMI 1640(Gibco)培養(yǎng)液中，對數(shù)期BGC-823細胞接種至24孔細胞板，1×105/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，至細胞貼壁并鋪滿大部分板底。根據(jù)文獻選擇1∶2毒素滴度，終體積1 ml，作用24 h［10］。分為 3 組:VacA 對照組加入上述未經(jīng)藥物處理的粗制VacA蛋白;AH處理組加入經(jīng)溴酸檳榔堿處理后的粗制VacA蛋白;細胞對照組加入不含VacA的細胞培養(yǎng)液1 ml。24 h后吸棄上清，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。每孔加入0.05%中性紅 PBS 溶液 200 μl，置室溫孵育 8 min，500 μl PBS洗3次，加入200 μl 75%酸化乙醇，酶標儀測定570 nm 吸光值(A570)［10］。

1.7 半定量RT-PCR檢測 使用革蘭陰性細菌RNA提取試劑盒(OMEGA)進行細菌RNA提取，測定各樣本的 OD260和 OD280，以定量 RNA濃度，OD260/OD280＞1.8可用于實驗。用10 μg RNA樣本，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)進行逆轉(zhuǎn)錄，反應體系和條件按照試劑盒說明書操作。用5 μl cDNA作為模板，以gyrB為內(nèi)參，按照PCR Master Mix試劑(Fermentas)使用說明，分別用VacA和gyrB引物，使用PCR Master Mix試劑(Fermentas)進行PCR檢測，分析VacA mRNA表達水平，VacA引物為 F 5'-CAATCTGTCCAA TCAAGCGAG-3'，R 5'-GCGTCTAAATAATTCCAAGG-3'，產(chǎn)物長度 570bp。gyrB引物為 F 5'-CGCTAAAGAAAGTGGCACGAC-3'，R 5'-TGCGCGTTTCTTC ATCCAT-3'，產(chǎn)物長度265bp。反應條件為:94℃ 5 min預變性;94℃ 15 s，55℃ 30 s(gyrB)/52℃ 30 s(vacA)，72℃ 1 min，35 個循環(huán)(gyrB)/40 個循環(huán)(vacA);72℃ 7 min延伸。5 μl PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，80V恒壓電泳30 min。用GBOX CHEMI圖像分析系統(tǒng)采集圖像，并使用smartview軟件讀取密度值。結(jié)果用目的基因/gyrB密度值表示。

1.8 細菌菌體蛋白和分泌蛋白樣本的制備 菌體蛋白制備:收集含藥物固體培養(yǎng)基上的細菌，PBS洗3次，沉淀加入1 ml細菌裂解液(8 mol· L－1脲素、4%CHAPS、1%pharmalyte(pH 3 ～10)、1%蛋白酶抑制劑混合物，用前加1%DTT。)懸浮。采用300W超聲粉碎細菌(工作10 s，間隔10 s)直至上清變清澈。4℃ 12 000 r·min－1離心 40 min，取上清。用考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒(南京建成)定量蛋白濃度，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分泌蛋白制備:收集在含藥物液體培養(yǎng)基中生長的細菌，將其高速離心，0.22 μm濾膜過濾，上清加入10%1 mol· L－1三氯乙酸，4℃放置3 h以上，直至看到沉淀。4℃ 80 000 r·min－1離心20 min，棄上清，沉淀加入1 ml丙酮洗滌3次，空氣中自然干燥。沉淀蛋白加入細菌裂解液溶解，定量蛋白濃度，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 Western blot 取50 μg總蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，10%分離膠20 mA 15 min，3%堆積膠10 mA 1 h，200 mA 50 min轉(zhuǎn)膜，TTBS(100 mmol· L－1Tris-HCI，0.9%(W/V)NaCl，0.1%(V/V)Tween 20，pH 7.5)5 min洗3次，以5%脫脂奶粉TTBS封閉，常溫震蕩1 h。分別加入1∶250 VacA單抗(Santa Cruz)或1∶500 GAPDH單抗(Santa Cruz)，4℃孵育過夜，TTBS洗 3次，加入1∶5 000稀釋的HRP標記二抗 (上海聯(lián)科)，RT震蕩1 h，TTBS 5 min洗3次，去除未結(jié)合二抗。取等量ECL發(fā)光劑(A液、B液各1 ml)混勻，浸膜3～5 min，曝光后顯影 5～60 s，定影 2 min。用 GBOX CHEMI圖像分析系統(tǒng)采集圖像，并使用smartview軟件讀取密度值。菌體蛋白中空泡毒素A的表達以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果用目的蛋白/GAPDH密度值之比表示，上清中空泡毒素A的表達直接以目的蛋白密度值表示。

1.10 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 13.0專業(yè)統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，各試驗組與對照組間差異性采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 細菌鑒定 肉眼可見直徑約為0.2～1.0 mm的圓形、半透明或透明的灰白色或無色的針尖樣細小菌落，典型菌落經(jīng)革蘭染色后，油鏡下可見革蘭陰性、弧形、S形或海鷗展翅狀的典型形態(tài)，可判定為H.pylori(Fig 1)。進一步生化學鑒定顯示，快速尿素酶試驗、氧化氫試驗、氧化酶試驗均陽性者可確認為 H.pylori菌株［11］。

Fig 1 Morph of H.pylori observed by high power with staining of Gram

2.2 中藥活性成分對H.pylori生長具有抑制作用 本研究首先使用平皿稀釋固體法和腦心浸液液體法測定中藥活性成分氫溴酸檳榔堿對H.pylori的最低抑菌濃度(MIC)，以反映藥物對H.pylori的抑制作用。結(jié)果顯示二者均可以在體外抑制H.pylori的生長，其 MIC固體法為 1.25 g·L－1，液體法為 1.25 g·L－1。

2.3 中藥活性成分對H.pylori分泌的VacA活性的影響 本研究進一步檢測了氫溴酸檳榔堿在體外對H.pylori分泌的VacA活性的影響。經(jīng)細胞毒實驗篩選出對細胞無毒性作用的細胞濃度，且遠低于相應MIC藥物濃度的氫溴酸檳榔堿(0.15 g·L－1)干預處理的H.pylori培養(yǎng)上清，作用于BGC-823細胞，24 h后通過中性紅攝入法，檢測H.pylori分泌的VacA的細胞毒性，并以未經(jīng)藥物處理的H.pylori培養(yǎng)上清為VacA毒性對照組，和未加入VacA蛋白的細胞為細胞對照組。使用抑制率表示藥物對VacA活性的抑制能力。抑制率/%=［1－(處理組OD－細胞對照組OD)/(VacA毒性對照組OD－細胞對照組OD)］×100%。結(jié)果顯示，與細胞對照組相比較，未經(jīng)藥物處理的VacA蛋白對BGC-823細胞具有明顯的毒性作用(P＜0.01)，氫溴酸檳榔堿可明顯抑制VacA的活性，P＜0.01(Fig 2A)。其對VacA活性的抑制率達100%(Fig 2B)。

2.4 氫溴酸檳榔堿對VacA mRNA和蛋白表達水平的影響 進一步使用不抑制H.pylori生長的藥物濃度的氫溴酸檳榔堿(0.15 g· L－1)干預細菌24 h，收集細菌和培養(yǎng)上清，細菌菌體經(jīng)細胞裂解后，檢測細菌菌體中VacA mRNA和蛋白表達水平;并檢測細胞培養(yǎng)上清中VacA的蛋白水平，同時以藥物未干預細菌為對照。結(jié)果顯示:與對照組相比，氫溴酸檳榔堿可明顯抑制菌體內(nèi)空泡毒素A mRNA(P＜0.05)和蛋白(P＜0.01)水平(Fig 3A)。且可明顯抑制H.pylori上清中VacA蛋白的表達(P＜0.01)(Fig 3B)。

3 討論

目前針對H.pylori治療雖已建立相當有效的根治措施［12］。但下列問題仍使臨床醫(yī)生感到棘手:①正在逐漸上升的H.pylori耐藥性;②降低的根除率和升高的復發(fā)率;③患者對治療方法的依順性［13］。這些問題都提示我們需要從新的視角去審視H.pylori的致病機制及其治療策略。且有關(guān)H.pylori作為潛在正常微生物群的觀點也使醫(yī)學界需要更審慎的考慮這個問題。

受此提示，本研究選取了中藥檳榔、大腹皮的主要活性成分氫溴酸檳榔堿(AH)觀察其對VacA是否具有設(shè)想中的抑制作用。結(jié)果顯示在低于最低抑菌濃度(MIC)近十分之一濃度時，AH可以明顯抑制H.pylori分泌的VacA的細胞毒性作用，可以抑制VacA對細胞的空泡化毒性效應。此結(jié)果與早期以中藥生藥水煎劑所進行的同類研究結(jié)果吻合，證實檳榔、大腹皮中對VacA細胞毒性起抑制作用的藥理成分是AH。且經(jīng)換算，該劑量在臨床用藥的安全范圍之內(nèi)。而產(chǎn)生抑菌作用之濃度已大于該藥的安全范圍［14］。

Fig 2 Effects of AH on activities of VacA secreted by H.pylori in vitro

本研究繼續(xù)在VacA形成的mRNA及蛋白的表達和分泌水平上，分別對上述現(xiàn)象進行了驗證，結(jié)果顯示，AH對菌體內(nèi)VacA mRNA及蛋白表達的抑制作用具有較好的一致性。且同時具有對VacA蛋白分泌的抑制作用。但其具體的抑制機制尚有待進一步研究。

Fig 3 Effects of AH on mRNA and protein level of VacA expressed in H.pylori or secreted by H.pylori

盡管AH已經(jīng)是一個臨床應用久遠的合成藥物，但其針對H.pylori毒素形成的抑制作用尚屬首次發(fā)現(xiàn)，考慮到AH自身的藥物副作用和抑制H.pylori毒素形成的時效問題尚需進一步研究，故其臨床應用尚有待時日。不過，不以殺菌為目的，而以抑制毒素形成為手段的應對策略，對于H.pylori所引起之疾病以及類似的機會性感染都是一個值得考慮的探索方向，也是臨床新的藥理作用(尤其是中藥)發(fā)現(xiàn)與開發(fā)的一條蹊徑。

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