陶 莉，望運玲，武雙嬋，田 輝，王玉婷，岳 源，謝劍梅，徐東波，丁 虹

(1.武漢大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)實驗室，湖北武漢 430071;2.宜昌市第二人民醫(yī)院，湖北宜昌 443000)

丁香屬于芳香類藥物，有激勵情緒、增加意志、提神醒腦、強化記憶等功效，在治療腦部的疾病中已經(jīng)有上千年的歷史［2］。丁香酚是從丁香油或其它含丁香酚的芳香油中蒸餾分離而得，現(xiàn)代研究表明，丁香酚具有麻醉、解熱、抗炎、抗氧化等多種藥理活性［3］，亦能透過血腦屏障，故在神經(jīng)障礙、癲癇、腦血管疾病以及老年性癡呆的防治中得到廣泛應(yīng)用。

腦缺血/再灌注引起的神經(jīng)損傷與氧自由基過度釋放、炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)［4］。自由基的產(chǎn)生遠遠超過自身內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力，過多的自由基通過損害血管內(nèi)皮、破壞細胞膜和細胞器中的不飽和脂肪酸等損傷神經(jīng)組織。而過度的炎癥反應(yīng)不僅影響局部的血液供應(yīng)，還會直接破壞組織結(jié)構(gòu)，NF-κB是一種廣泛存在、功能多樣的核轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血時，可被特異性激活，與腦缺血/再灌注損傷的炎癥機制密切相關(guān)。本實驗通過局灶性腦缺血/再灌注損傷模型(MCAO)，研究丁香酚對腦缺血損傷的保護作用并探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級♂SD大鼠，體質(zhì)量200～240 g，鼠齡3～4個月，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供〔許可證號SCXK(鄂)2008-0004〕。

1.2 儀器 離心機(飛鴿牌系列)，分析天平(HANGPING FA1004)。

1.3 藥品和試劑 丁香酚(上海紫一試劑廠);紅四氮唑(TTC)，中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑總廠;谷胱甘肽試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛試劑盒、過氧化氫酶試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 分組與給藥 成年健康♂SD大鼠48只，隨機分為3組，每組16只。①假手術(shù)組:腹腔注射生理鹽水;②模型組:腹腔注射生理鹽水;③丁香酚組:預(yù)處理15 d，腹腔注射丁香酚(200 mg·kg－1)。飼養(yǎng)于實驗室內(nèi)，自由進食及飲水，讓其適應(yīng)環(huán)境。手術(shù)前1天禁食禁水。

2.2 腦缺血/再灌注模型的制備 采用Longa等的方法制備局灶性腦缺血/再灌注模型。腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉。仰臥位固定在手術(shù)板上，頸正中切口，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露左側(cè)的血管和神經(jīng)，分離出頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)。結(jié)扎CCA的近心端和 ECA，用動脈夾夾閉 ICA，并在CCA上剪開一小口，插入線栓，松開夾住ICA的動脈夾，將線栓緩緩向顱內(nèi)推進約1.8～2.0 cm，假手術(shù)組線栓只插入1.0 cm，其余步驟同模型組。將線栓和ICA結(jié)扎固定，逐漸縫合肌肉和皮膚。2 h后拔出線栓造成血流再灌注模型。

2.3 TTC染色［5］再灌注后22 h，每組取6只大鼠，用10%水合氯醛深麻醉后處死，迅速取腦，冰凍10 min，從視交叉處取冠狀面均勻切成厚2 mm腦片，放入2%TTC溶液(37℃)中染色30min，然后用4%甲醛緩沖液固定。24 h后拍照并輸入計算機，用AUTO-CAD圖像處理軟件計算梗死面積(粉紅色區(qū)為正常腦組織，白色區(qū)為梗死區(qū))，各腦片梗死面積之和乘以厚度(2 mm)為總的梗死體積，以梗死體積/全腦體積比作為統(tǒng)計參數(shù)。

2.4 行為學(xué)評分

2.4.1 神經(jīng)功能評分［6］于缺血/再灌注后 12、24、48、72 h進行神經(jīng)功能評分，具體參照 Longa 5級4分制評分標(biāo)準進行神經(jīng)功能評定。即:0分，無神經(jīng)損傷癥狀;1分，不能完全伸展對側(cè)前爪;2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分，向?qū)?cè)傾倒;4分，不能自發(fā)行走，意識昏迷。

2.4.2 平衡木行走試驗［7］平衡木行走試驗用于評定模型大鼠感覺運動整合能力以及平衡協(xié)調(diào)能力。術(shù)前1周每天早晚各訓(xùn)練1次，每次10 min，使其能順利在平橫木上行走，于缺血/再灌注后24、48、72 h進行評分。評分標(biāo)準如下:0分，穿過平衡木，不會跌倒;1分，穿過平衡木，且有小于50%的路程中出現(xiàn)腳滑現(xiàn)象;2分，穿過平衡木，但有大于50%的路程中出現(xiàn)腳滑現(xiàn)象;3分，能穿過平衡木，但癱瘓側(cè)后肢不能幫助向前移動;4分，不能穿過平衡木，但可坐在平衡木上面;5分，將大鼠放在平衡木上會掉下來。

2.5 生化評價［8］行為學(xué)評分后，每組取6只大鼠，斷頭取腦，切取大腦。稱取部分腦組織用0.9%生理鹽水制成1%的腦組織勻漿液，離心3 500 r·min－1，取上清液，－20℃保存。取上清測定蛋白濃度，按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書測定谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性。

2.6 蛋白定量測定 采用BCA蛋白試劑盒測定樣本中總蛋白含量。

2.7 NF-κB 檢測［9－10］取腦組織，用 4 倍體積的裂解液制成勻漿，蛋白定量測定后，Western blot檢測含量。

2.8 組織病理學(xué)分析［11－12］行為學(xué)評分后，每組隨機取4只大鼠，取血后斷頭取腦，用10%的中性福爾馬林液固定，7～14 d后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織結(jié)構(gòu)變化。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件統(tǒng)計，實驗數(shù)據(jù)用±s表示。

3 結(jié)果

3.1 TTC染色結(jié)果 大鼠腦缺血/再灌注后均出現(xiàn)不同程度的缺血梗死，丁香酚組梗死灶面積/腦切片面積與模型組比較明顯降低，差異有顯著性，見Fig 1。

Fig 1 TTC staining Results of sham group(A)，model group(B)and eugenol group(C)

3.2 行為學(xué)評分結(jié)果

3.2.1 神經(jīng)功能評分 Fig 2A的評分結(jié)果顯示，丁香酚組對腦缺血模型大鼠的神經(jīng)功能有不同程度的保護作用。在術(shù)后第48、72 h評分中，丁香酚組與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.01)。

3.2.2 平衡木行走試驗 術(shù)后24 h，除假手術(shù)組外，各組大鼠均出現(xiàn)平衡功能障礙，模型組與丁香酚組差異無顯著性(P＞0.05)，但與假手術(shù)組差異有顯著性(P＜0.01)。術(shù)后48、72 h，除假手術(shù)組外，各組大鼠平衡功能改善，模型組與丁香酚組差異有顯著性(P＜0.05)，見Fig 2B。

3.3 生化評價結(jié)果 Tab 1顯示MCAO模型對大鼠腦組織中GSH、MDA、SOD、CAT活性的影響以及丁香酚對其的保護作用。與假手術(shù)組相比，模型組中除MDA含量增加外，其余活性均明顯降低;而與模型組相比，丁香酚組則能明顯提高GSH、SOD、CAT的活性，降低MDA的含量。進一步說明了丁香酚能在一定程度上改善由腦缺血引起的氧化損傷。

Tab 1 Protective effect of eugenol on the activities of antioxidant enzymes(GSH，MDA，SOD and catalase)in brain of MCAO rats 72 h after reperfusion(±s，n=6)

Tab 1 Protective effect of eugenol on the activities of antioxidant enzymes(GSH，MDA，SOD and catalase)in brain of MCAO rats 72 h after reperfusion(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 MCAO vs sham;##P＜0.01 Eugenol vs MCAO

Parameters GSH/mg·g－1Pro Pro Sham 0.050 ±0.003 1.21 ±0.25 146.04 ±12.53 4.6 MDA/mg·g－1Pro SOD/U·g－1Pro CAT/U·g－1 6 ±0.20 MACO 0.038 ±0.005＊＊1.62 ±0.27＊＊ 90.02 ±25.37＊＊1.76 ±0.41＊＊Eugenol 0.049 ±0.006##1.28 ±0.47##131.30 ±22.88##3.59 ±0.54##

Fig 2A Neurological scores of rats(±s，n=10)＊＊P＜0.01 MCAO vs sham，##P＜0.01 Eugenol vs MCAOFig 2BBeam-walking test scores of rats(±s，n=10)＊＊P＜0.01 MCAO vs sham;#P＜0.05 Eugenol vs MCAO

3.4 HE染色結(jié)果 光鏡下可見未缺血腦組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細胞形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)豐富，呈嗜堿性，核圓形，核仁清晰可見。模型組腦缺血核心區(qū)域神經(jīng)細胞構(gòu)型紊亂，部分結(jié)構(gòu)松散，胞體明顯縮小，胞質(zhì)濃染或嗜伊紅，尼氏體消失，核固縮為三角形。與模型組相比，丁香酚組以上神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)改變減輕，見Fig 3。

Fig 3 HE staining Results of sham group(A)，model group(B)and eugenol group(C)(×400)

3.5 Western blot檢測NF-κB的表達結(jié)果 模型組大鼠NF-κB的表達(0.989±0.21)高于假手術(shù)組(0.737±0.10)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);丁香酚組NF-κB表達(0.870±0.15)低于模型組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見Fig 4。

Fig 4 Influence of eugenol on expression of NF-κB in MCAO rats

4 討論

實驗結(jié)果顯示，丁香酚能明顯改善腦缺血/再灌注的神經(jīng)功能損傷，減小左側(cè)大腦的梗死面積，減輕腦缺血/再灌注大鼠皮層區(qū)城神經(jīng)元的核固縮和細胞數(shù)目的減少，升高 GSH、SOD、CAT活性，降低MDA含量，下調(diào)NF-κB的表達，結(jié)果證實丁香酚對腦缺血/再灌注大鼠腦損傷有保護作用。

急性腦缺血后，缺血中心區(qū)神經(jīng)細胞壞死，釋放出蛋白水解酶、活性氧(ROS)等物質(zhì)，引發(fā)局部炎癥反應(yīng)。有研究表明，腦缺血/再灌注損傷與ROS激活有關(guān)，本次實驗證明丁香酚是通過其抗氧化特性來減少氧化損傷和神經(jīng)元缺失，進一步說明丁香酚能夠提供很好的神經(jīng)保護作用。眾所周知，氧化應(yīng)激會導(dǎo)致缺血后的神經(jīng)元損傷，促進脂質(zhì)過氧化作用并改變腦內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，通過給予丁香酚治療后，能明顯改善這種狀況。多數(shù)研究者認為，NF-κB活化是腦缺血后炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)［13］。局部腦缺血時NF-κB活化有促進細胞死亡的作用，采用一些降低 NF-κB活性的措施，能縮小腦梗死體積［14］。本研究證實，在模型組大鼠腦缺血/再灌注3 h新皮質(zhì)NF-κB活性已明顯增高，并隨再灌注時間延長持續(xù)快速升高，故認為，腦缺血/再灌注早期NF-κB活化可能參與了繼發(fā)性腦損傷而增大了腦梗死體積［15－16］。

因此，丁香酚在治療神經(jīng)退行性疾病(如急性腦缺血)方面具有巨大的潛在價值。

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