黃 倩，楚世峰，張均田，陳乃宏

(1.天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新藥作用機(jī)制研究與藥效評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

抑郁癥(depression)是由各種原因引起的以抑郁為主要癥狀的一組心境障礙或情感性障礙，包括注意缺失、無快感體驗(yàn)、睡眠障礙、反復(fù)自殺念頭等，是一種高發(fā)病、高致殘、高復(fù)發(fā)的疾?。?］。其病因和病理生理學(xué)機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明?？赡芘c社會(huì)、心理，以及遺傳、應(yīng)激、神經(jīng)內(nèi)分泌異常、神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂等各種生物學(xué)因素有關(guān)［2］。目前突觸丟失以及突觸超微結(jié)構(gòu)的改變也被認(rèn)為是抑郁發(fā)病機(jī)制之一，越來越受到人們的關(guān)注［3］。人參(Panax ginsengCA Mey)是五加科植物的根莖，享有百草之王的美譽(yù)。人參皂苷Rgl是人參的標(biāo)志性成分，前期研究已經(jīng)證明，人參皂苷Rg1具有改善神經(jīng)退行性疾病的作用，如老年癡呆、腦缺血、帕金森病。它還能夠增加神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性，具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用［4］。而人參皂苷Rg1是否具有抗抑郁的作用并沒有得到廣泛的研究和認(rèn)同，所以本研究是通過慢性應(yīng)激模型來探討人參皂苷Rg1的抗抑郁活性以及對(duì)突觸超微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 ♂ SD 大鼠，250～300 g，60只，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。合格證編號(hào):SCXK-2011V0012。大鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房中，平均室溫和相對(duì)濕度控制在(22±2)℃和(55±5)%。無應(yīng)激期間，5只動(dòng)物一籠。動(dòng)物在動(dòng)物房中適應(yīng)5 d后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥品與試劑 人參皂苷Rg1(云南極粹生物科技有限公司提供，純度≥98%);鹽酸度洛西汀腸溶膠囊(禮來蘇州制藥有限公司，批號(hào):A873537C)。戊二醛固定液、四氧化鋨固定液、Epon812樹脂包埋劑、醋酸雙氧鈾染液、檸檬酸鉛染液均由北京神經(jīng)外科研究所超微病理研究室提供。

1.1.3 主要儀器 H-7650投射電子顯微鏡(Hitachi公司，北京神經(jīng)外科研究所超微病理研究室)。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 SD♂大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只。①正常組:正常飼養(yǎng);②模型組:接受28 d慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激制備抑郁模型。③陽性對(duì)照組:抑郁模型 +度洛西汀(10 mg·kg－1);④ 人參皂苷Rg1低劑量組:抑郁模型+人參皂苷Rg1(5 mg·kg－1);⑤人參皂苷Rg1中劑量組:抑郁模型+人參皂苷Rg1(10 mg·kg－1);⑥人參皂苷Rg1高劑量組:抑郁模型+人參皂苷Rg1(20 mg·kg－1)。人參皂苷Rg1易溶于水，雙蒸水溶解，分別配制成 0.5、1、2 g·L－1溶液;度洛西汀將其膠囊中內(nèi)容物放入研缽研成粉末，加入雙蒸水，制成1 g·L－1混懸液)，單次單劑量灌胃給藥。正常組和模型組以相同方式按體重給予雙蒸水。

1.2.2 慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激大鼠模型 按照文獻(xiàn)方法［5］進(jìn)行抑郁大鼠模型的制備。除正常組之外其余各組均接受慢性應(yīng)激28 d，包括:禁食24 h，禁水 24 h，噪音 1 h，傾斜 45°12 h，冰水游泳 10℃6 min，通宵照明 12 h，夾尾 1 min，擁擠 12 h，束縛 4 h，水平振蕩 160 r·min－145 min，濕墊料 12 h。每天隨機(jī)選擇2種刺激，共28 d。

1.2.3 行為學(xué)測(cè)定 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn):給藥1 h后，將大鼠置于直徑50 cm，水深30 cm，水溫(25±2)℃的圓桶中，觀察5 min，記錄各組動(dòng)物在整個(gè)5 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)狀態(tài)為:大鼠在水中停止掙扎，或呈漂浮狀態(tài)，僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面的狀態(tài)。

糖水消耗實(shí)驗(yàn):快感缺失是抑郁癥的核心癥狀，對(duì)動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)則以一定時(shí)間內(nèi)消耗一定濃度的蔗糖溶液量或百分比為衡量標(biāo)準(zhǔn)。首先給予大鼠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蔗糖溶液預(yù)適應(yīng)48、24 h后大鼠禁食禁水12 h，之后每只大鼠單籠飼養(yǎng)給予兩只相同的水瓶，分別裝有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蔗糖水和正常飲用水，統(tǒng)計(jì)1h內(nèi)大鼠攝入的蔗糖溶液和飲用水量，計(jì)算出蔗糖消耗百分比〔蔗糖消耗百分比=蔗糖溶液攝入量/(蔗糖溶液攝入量+飲用水?dāng)z入量)〕。

1.2.4 電鏡生物樣品制備 各組大鼠行為測(cè)試之后以水合氯醛腹腔麻醉，灌流固定，開顱取腦，在解剖鏡下切取額前皮質(zhì)區(qū)組織塊，并將該組織切成1 mm3的小塊，經(jīng)四氧化鋨固定2 h后，梯度酒精脫水，Epon812包埋，超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，每例觀察3張銅網(wǎng)，先在低倍率(×5 000)下觀察，最終放大到10萬倍拍照，每只大鼠至少拍攝4對(duì)清晰的突觸結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1對(duì)抑郁大鼠絕望行為的影響強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物在水中的不動(dòng)時(shí)間說明了抑郁動(dòng)物的一種絕望行為。模型組大鼠的不動(dòng)時(shí)間與正常組相比有明顯增加(P＜0.01)。人參皂苷Rg1 5、10、20 mg·kg－1組與模型組相比，不動(dòng)時(shí)間明顯減少(P＜0.01)，見 Tab 1。

2.2 人參皂苷Rg1對(duì)抑郁大鼠興趣缺失行為的影響 興趣缺失是抑郁癥的核心癥狀之一，而糖水消耗實(shí)驗(yàn)可以反映大鼠的快感缺失狀態(tài)。Tab 2的結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠糖水?dāng)z入百分比明顯降低(P＜0.01)，而給予人參皂苷Rg1 5、10、20 mg·kg－1組均可明顯增加應(yīng)激大鼠的糖水?dāng)z入百分比(P＜0.01)。

Tab 1 Effects of Ginsenoside Rg1 on immobility time in forced swim test in rats(n=10)

Tab 2 Effects of Ginsenoside Rg1 on sucrose intake percentage in sucrose preference test in rats(n=10)

2.3 慢性應(yīng)激對(duì)大鼠前額皮層突觸超微結(jié)構(gòu)的影響及人參皂苷Rg1的改善作用 我們主要觀察的是前額皮層突觸前膜附近的突觸囊泡密度和突觸后致密物質(zhì)厚度。如Fig 1所示，圖中突觸均為GrayⅠ型突觸，即后膜致密物比前膜厚，兩膜之間有明顯的突觸間隙，稱為不對(duì)稱突觸，也是興奮性突觸。

Fig 1 Ginsenoside Rg1 improves synaptic ultrastructure in prefrontal cortex of CUMS rats(n=3)

對(duì)照組，突觸前膜附近聚集著許多突觸囊泡，以清亮圓形無核心小泡為主，比較密集;突觸后膜有濃密的電子致密物質(zhì)，較厚。模型組與對(duì)照組相比，突觸前膜附近的突觸囊泡密度明顯減小，變得稀疏;突觸后致密物質(zhì)厚度也明顯減小。給予人參皂苷Rg1低、中、高劑量和陽性藥度洛西汀，均能改善突觸的異常變化。尤其Rg1 10、20 mg·kg－1組與模型組相比，突觸前膜附近的突觸囊泡密度明顯變大，突觸后致密物質(zhì)厚度也明顯增大，與正常組很接近。

3 討論

慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激(CUMS)可模擬一系列抑郁癥的核心癥狀，如興趣缺失、絕望行為、睡眠障礙等等，是一個(gè)典型的、常用的研究抑郁模型，用于抗抑郁新藥的篩選、臨床作用機(jī)制及抑郁癥病理生理機(jī)制的研究。本研究采用CUMS建立大鼠抑郁模型，選擇強(qiáng)迫游泳和糖水偏好這兩個(gè)經(jīng)典的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，來檢測(cè)抑郁大鼠的絕望行為和興趣缺失等行為障礙。我們的研究結(jié)果證明了人參皂苷Rg1 5、10、20 mg·kg－1劑量均能減少抑郁大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間，增加糖水的攝入量，對(duì)CUMS誘導(dǎo)的抑郁行為和突觸超微結(jié)構(gòu)的異常有很好的改善作用。但人參皂苷Rg1高、中、低劑量組之間并沒有表現(xiàn)出量效關(guān)系，在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中均呈陽性結(jié)果，且組間差異無顯著性?？赡茉蚴窃谏窠?jīng)精神領(lǐng)域的研究中，往往存在最適劑量，并不是在一定劑量范圍內(nèi)，隨劑量增加作用效力也增加，因?yàn)樯窠?jīng)通路、神經(jīng)遞質(zhì)及受體間的影響因素太多。

大量研究證明，應(yīng)激可以導(dǎo)致腦內(nèi)結(jié)構(gòu)的改變，這種改變集中體現(xiàn)在神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑上，如突觸、樹突、樹突棘及細(xì)胞的數(shù)量。抑郁大鼠的腦中多個(gè)腦區(qū)都存在突觸和突觸棘丟失的現(xiàn)象，樹突長(zhǎng)度也有縮短，如海馬、額前皮質(zhì)、前扣帶皮層等［6－7］。額前皮質(zhì)區(qū)，是一個(gè)與情緒調(diào)節(jié)有著密切的聯(lián)系腦區(qū)。額葉受損的人，嚴(yán)重影響著他的情緒和社會(huì)行為，大多數(shù)人容易患有精神分裂癥、重性抑郁和焦慮［8］。因此本研究選擇了額前皮質(zhì)區(qū)作為主要的腦內(nèi)區(qū)域，來研究抑郁癥造成的突觸結(jié)構(gòu)的變化。有文獻(xiàn)報(bào)道［9］，應(yīng)激可導(dǎo)致額前葉皮層突觸數(shù)量減少，而且額前葉皮層容積也有所縮小。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，長(zhǎng)期應(yīng)激會(huì)使大鼠額前皮質(zhì)區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，突觸前膜的突觸囊泡密度明顯減小，突觸后致密物質(zhì)厚度也明顯減小。在口服給予人參皂苷Rg1后，突觸囊泡密度和突觸后致密物厚度都有明顯增大，抑郁的行為也有所改善。

我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究還證明，人參皂苷Rg1能改善認(rèn)知功能和性功能障礙，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，提高突觸可塑性和神經(jīng)發(fā)生，還具有雌激素樣的保護(hù)作用［10－13］。這些研究都說明人參皂苷Rg1除了能改善抑郁的核心癥狀外，還能治療抑郁的一些伴隨癥狀，如認(rèn)知障礙、性功能障礙等等。而且從微觀的角度去探究抑郁癥機(jī)制，人參皂苷Rg1還能夠改善突觸的超微結(jié)構(gòu)。因此人參皂苷Rg1很有可能成為臨床新型、安全的抗抑郁劑。

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