洪 波，錢 韻，姚航平

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科，浙江杭州 310009;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，浙江杭州 310009;3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310003）

胰腺癌是一種以起病隱匿、生長(zhǎng)迅速并早期轉(zhuǎn)移為特征的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，是死亡率最高的惡性腫瘤之一，目前尚無(wú)有效的治療措施，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)。由于胰腺組織的解剖位置關(guān)系，早期癥狀不明顯且缺乏有效的檢測(cè)手段，大多數(shù)患者就診時(shí)已為中晚期，預(yù)后差，5年生存率不足5%［1-2］。早期發(fā)現(xiàn)與早期診斷是改善胰腺癌患者預(yù)后的有效措施之一。因此，尋找早期診斷、特異性強(qiáng)、靈敏度高的腫瘤分子標(biāo)記物對(duì)于改善胰腺癌患者的預(yù)后具有重要的臨床意義，同時(shí)也能為胰腺癌新型靶向治療技術(shù)提供依據(jù)。B7-H4(也稱為B7S1或B7x)是新近發(fā)現(xiàn)的B7家族成員，能抑制T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞周期的進(jìn)行，從而抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答［3-6］。B7-H4在腫瘤免疫應(yīng)答中起重要作用。B7-H4 mRNA的在脾、肺、胸腺、胎盤、肝、腎等正常組織中均有表達(dá)［3］，然而，B7-H4蛋白在正常外周組織中幾乎沒(méi)有陽(yáng)性表達(dá)［3］，而在一些腫瘤組織中有豐富表達(dá)，例如乳腺癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌［7-12］，并與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。鑒于目前尚無(wú)可用于多種方法檢測(cè)B7-H4表達(dá)的抗體出售，本研究以穩(wěn)定表達(dá)B7-H4的3T3-B7-H4細(xì)胞為免疫原，制備了能穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)特性分析。爾后應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)B7-H4在胰腺癌組織中的表達(dá)，探討B(tài)7-H4的表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，分析B7-H4在胰腺癌診療及預(yù)后判斷等方面的潛在價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料 3T3-B7-H4細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建［13］;SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;Balb/C小鼠由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供;重組人B7-H4蛋白和山羊抗B7-H4多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R＆D Systems公司;HRP酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgM抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz biotechnology公司;HRP酶標(biāo)記兔抗山羊IgG抗體購(gòu)自美國(guó)KPL公司;細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM、篩選培養(yǎng)基HAT和HT均購(gòu)自美國(guó)Life Technologies/Gibco?公司;蛋白L抗體純化柱購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific/Pierce公司;單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad Company/AbD Serotec公司;小鼠IgM同型對(duì)照抗體購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司;其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。免疫組化染色分析胰腺癌及邊緣組合芯片(石蠟包埋)購(gòu)自陜西艾麗娜生物科技有限公司。免疫組化EnVision System試劑盒購(gòu)自丹麥DAKO公司。

1.2 抗B7-H4單克隆抗體的制備

1.2.1 小鼠免疫 取4～6周齡Balb/C小鼠(5只)，用培養(yǎng)的3T3-B7-H4細(xì)胞進(jìn)行腹腔免疫，每只小鼠5×106/次，每2周1次，共5次，最后1次免疫3 d后取免疫小鼠脾細(xì)胞。

1.2.2 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的建立 ①細(xì)胞融合:按常規(guī)方法取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合［14］，用含HAT的完全培養(yǎng)基將融合后的細(xì)胞懸浮，并加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞(小鼠腹腔巨噬細(xì)胞)混勻后分散于96孔板中，于37℃、5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后用含HAT的完全培養(yǎng)基半量換液。②克隆化培養(yǎng):選擇性培養(yǎng)2周后更換為含HT的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以重組B7-H4蛋白包被ELISA板，采用間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液。篩選能分泌目的抗體的雜交瘤細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋培養(yǎng)，經(jīng)4次有限稀釋后，將細(xì)胞擴(kuò)增到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。由此，獲得了1株分泌抗B7-H4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3E8。細(xì)胞株體外連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月，經(jīng)間接ELISA檢測(cè)證實(shí)抗體分泌能力穩(wěn)定。將能穩(wěn)定分泌3E8單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存于液氮中保存。③間接ELISA法:將重組B7-H4蛋白以200 ng/孔包被于酶標(biāo)板上過(guò)夜;PBST洗板5次，將制得的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液做系列稀釋，以每個(gè)濃度100μl加入各孔中，室溫?fù)u床溫育2 h;PBST洗板5次，加1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗，室溫?fù)u床溫育1 h;PBST洗板5次，加入 TMB顯色液100μl/孔，顯色5 min;2N 的硫酸終止液50μl/孔，終止反應(yīng);置于酶標(biāo)儀上，測(cè)定其在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度。以未進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基和正常小鼠血清為陰性對(duì)照。

1.2.3 抗B7-H4單克隆抗體的制備 取6～8周雄性Balb/C小鼠(n=5)，每只腹腔注射約2×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞。約7～12 d后當(dāng)小鼠腹部明顯膨脹后收集腹水，10000×g離心10 min取上清液用蛋白L抗體純化柱純化分裝(質(zhì)量濃度為1.5 mg/ml)后置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 抗B7-H4單克隆抗體效價(jià)滴定 用重組B7-H4蛋白包被ELISA板，利用間接ELISA法測(cè)定單克隆抗體效價(jià)，同時(shí)以小鼠同型對(duì)照抗體為陰性對(duì)照。以P/N＞2.0的最大稀釋度作為抗體效價(jià)。

1.4 抗B7-H4單克隆抗體生物學(xué)特性鑒定

1.4.1 亞型鑒定 用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒分析經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的單克隆細(xì)胞上清液中單克隆抗體的亞型(具體操作祥見(jiàn)說(shuō)明書)。

1.4.2 特異性鑒定 采用Western blot法和IP法對(duì)單克隆抗體特異性進(jìn)行鑒定。①Western blot法:3T3-B7-H4細(xì)胞裂解液和3T3細(xì)胞裂解液分別作SDS-PAGE電泳，然后按常規(guī)方法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，依次與稀釋1000倍的單克隆抗體及HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgM反應(yīng)后ECL曝光，山羊抗B7-H4多克隆抗體為陽(yáng)性抗體對(duì)照。②IP法:350 μg的3T3-B7-H4細(xì)胞裂解液和單克隆抗體(2 μg)通過(guò)蛋白L共沉淀，3T3細(xì)胞裂解液作為陰性對(duì)照，小鼠IgM同型對(duì)照抗體為抗體對(duì)照［14］。Western blot按上述方法進(jìn)行，依次與山羊抗B7-H4多克隆抗體及HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG反應(yīng)后ECL曝光。

1.5 免疫組化染色分析胰腺癌及邊緣組合芯片 正常組織來(lái)源于癌旁的遠(yuǎn)端組織(n=25)。胰腺癌組織來(lái)源于胰腺癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，114例胰腺癌患者年齡31～78歲(平均年齡55.64歲 ±9.56歲)，組織學(xué)類型均為腺癌;病理學(xué)分級(jí)為Ⅰ級(jí)高分化46例，Ⅱ級(jí)中分化48例，Ⅲ級(jí)低分化12例，Ⅳ級(jí)未分化8例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移100例。組織樣本的詳細(xì)臨床病理信息由芯片制造商提供(http://www.alenabio.com)。采用免疫組化EnVision System染色，操作按其說(shuō)明書進(jìn)行，用抗B7-H4單克隆抗體為一抗，小鼠IgM同型對(duì)照抗體代替一抗作為陰性對(duì)照。細(xì)胞漿及細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒狀物為B7-H4陽(yáng)性染色。染色結(jié)果判斷:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5% ～10%為1分，＞10% ～30%為2分，＞30% ～70%為3分，＞70%為4分;細(xì)胞染色強(qiáng)度:無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與相應(yīng)染色強(qiáng)度之和判定染色結(jié)果:0～1分為陰性，2～7分為陽(yáng)性，其中6～7 分為過(guò)表達(dá)［15］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 研究資料采用u檢驗(yàn)分析B7-H4在不同腫瘤組織中的表達(dá)以及在腫瘤組織中的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗B7-H4單克隆抗體效價(jià)滴定結(jié)果及亞型鑒定 3E8單克隆抗體的效價(jià)高于104(表1)，亞型為IgM，輕鏈為κ型(圖1)。

表1 ELISA檢測(cè)抗B7-H4單克隆抗體效價(jià)Table 1 ELISA analysis of anti-B7-H4 mAb

圖1 小鼠抗B7-H4單克隆抗體的亞型Fig.1 The isotype of anti-B7-H4 of mouse monoclonal antibody

2.2 抗B7-H4單克隆抗體生物學(xué)特性鑒定

2.2.1 穩(wěn)定性鑒定 雜交瘤細(xì)胞株體外連續(xù)傳代10代凍存于液氮中，復(fù)蘇后其上清液效價(jià)保持穩(wěn)定，表明雜交瘤細(xì)胞能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。

2.2.2 特異性鑒定 3E8單克隆抗體與相對(duì)分子質(zhì)量約28 kD和57 kD大小的蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)(圖2A)，與羊抗B7-H4多克隆抗體顯示的條帶一致(圖2B)。IP法檢測(cè)單克隆抗體與天然的B7-H4的結(jié)合活性。圖2C中可以看出，3E8單克隆抗體能特異地與3T3-B7-H4細(xì)胞裂解液中的B7-H4結(jié)合，與陰性對(duì)照3T3細(xì)胞裂解液無(wú)任何反應(yīng)。

圖2 抗B7-H4單克隆抗體的Western blot和IP鑒定Fig.2 3E8 mAb was detected by Western blot and IP analysis

2.3 B7-H4在胰腺癌組織中的表達(dá) 免疫組化檢測(cè)胰腺癌組織中B7-H4的表達(dá)，結(jié)果顯示，腫瘤組織中B7-H4呈彌漫性表達(dá)于胞漿和胞膜(圖3)。經(jīng)檢測(cè)胰腺癌組織中B7-H4平均染色積分為4.00±1.44，癌旁的正常組織中僅有少量表達(dá)或不表達(dá)，平均染色積分為1.12±0.78，胰腺癌組織中B7-H4染色積分顯著高于正常組織(P ＜0.01)。

圖3 B7-H4在胰腺癌組織中的表達(dá)(EnVision二步法)Fig.3 Expression of B7-H4 in pancreatic cancer tissue

2.4 胰腺癌組織中B7-H4的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 B7-H4在胰腺癌組織中表達(dá)水平與患者腫瘤病理分級(jí)有關(guān)，Ⅲ-Ⅳ級(jí)低分化組織的染色積分(6.10±0.72)顯著高于Ⅰ-Ⅱ級(jí)中低分化組織(3.55 ±1.12，P ＜0.01)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織染色積分為6.14±0.66，顯著高于沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織染色積分(3.70 ±1.25，P ＜0.01)。B7-H4 在胰腺癌組織中表達(dá)水平與患者年齡［31～55歲與56～80歲年齡段分別(3.98 ±1.41)與(4.02 ±1.49)］、性別［男性與女性分別(3.90 ±1.42)與(4.16 ±1.48)］無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(均 P ＞0.05)。

3 討論

胰腺癌以生長(zhǎng)迅速并早期發(fā)生轉(zhuǎn)移為特征，其病因及發(fā)病機(jī)制至今不明。腫瘤免疫學(xué)和分子免疫學(xué)研究的不斷進(jìn)步使腫瘤的免疫發(fā)病機(jī)制日益受到重視，成為全球生物醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4能抑制CD4+和CD8+的T細(xì)胞活化、增殖和 IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，阻斷細(xì)胞周期使細(xì)胞停滯于G0/G1期，抑制CD8+CTL的增殖和成熟，從而負(fù)向調(diào)控T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［3，5-6］，且 B7-H4 在腫瘤組織的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞的數(shù)量負(fù)相關(guān)，推測(cè)B7-H4負(fù)向調(diào)控抗腫瘤免疫應(yīng)答在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展中起重要作用［7-8，16］。最近研究表明，B7-H4 的異常表達(dá)和激活在上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用［7］。因此，我們推測(cè)，B7-H4作為負(fù)向免疫調(diào)控因子，可能在胰腺癌組織中異常表達(dá)，并參與胰腺癌的發(fā)病及進(jìn)展。

本課題首先試圖建立一種方便的B7-H4檢測(cè)方法。B7-H4是一種非常保守的抗原，人和小鼠的B7-H4基因序列同源性達(dá)到90%以上。它由282個(gè)氨基酸組成，蛋白分子結(jié)構(gòu)由1個(gè)信號(hào)序列、1個(gè)功能區(qū)及1個(gè)含羥基末端的跨膜功能區(qū)組成，其最顯著的特征是細(xì)胞質(zhì)區(qū)僅含有2個(gè)氨基酸殘基。B7-H4與其他B7家族成員一樣，在胞外區(qū)存在一個(gè)Ig樣的結(jié)構(gòu)域，但缺乏明顯的跨膜區(qū)［3，5-6］。利用 B7-H4的這一特性，我們制備了特異性抗B7-H4的鼠源單克隆抗體3E8。經(jīng)Western blot和IP證實(shí)該單克隆抗體能識(shí)別天然或變性的B7-H4，為下一步研究B7-H4在胰腺癌的表達(dá)及功能并建立相關(guān)診斷學(xué)方法奠定基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4在乳腺癌［8］、卵巢癌［17-18］、子宮內(nèi)膜癌［17］、腎細(xì)胞癌［10］以及非小細(xì)胞肺癌［12］中都有過(guò)度表達(dá)。Awadallah等［19］研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4可能成為胰腺癌診斷及預(yù)后的新標(biāo)記。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用自行制備的抗B7-H4單克隆抗體檢測(cè)，B7-H4在胰腺癌組織中呈彌漫性高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或弱表達(dá)，腫瘤組織中表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常組織，且低分化及未分化胰腺癌組織中的B7-H4表達(dá)水平顯著高于高、中分化胰腺癌組織，并在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的胰腺癌組織中表達(dá)顯著增強(qiáng)。B7-H4的異常表達(dá)提示B7-H4可能是一種潛在的胰腺癌病理標(biāo)志，參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，阻斷B7-H4與其受體的相互作用，有望成為腫瘤生物治療的潛在靶點(diǎn)［20-22］。

雖然B7-H4在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具體作用機(jī)制尚不十分明確，但它與胰腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)，作為胰腺癌患者治療的潛在靶位已逐漸受到關(guān)注。B7-H4在胰腺癌彌漫性高表達(dá)的特征為胰腺癌診斷預(yù)后和靶向治療提供了新策略;本實(shí)驗(yàn)制備的能穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株為進(jìn)一步研究B7-H4的生物學(xué)功能及建立相關(guān)診斷學(xué)方法奠定基礎(chǔ)。

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