宮 婷，李鴻立，巴一

(1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤科，天津 300052;2.天津市腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科，天津 300060）

近年來，世界多數(shù)國(guó)家大腸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，北美、歐洲各國(guó)大腸癌發(fā)病率居惡性消化道腫瘤第1位［1］?？鼓[瘤免疫以細(xì)胞免疫為主，依賴于多種效應(yīng)細(xì)胞的協(xié)調(diào)作用。樹突細(xì)胞作為功能最強(qiáng)大的抗原提成細(xì)胞，通過行使一系列功能，包括捕獲抗原、上調(diào)刺激信號(hào)、將抗原遞呈并激活T細(xì)胞，在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。但在腫瘤組織周圍樹突細(xì)胞多低表達(dá)或免疫功能低下，無法有效地處理和提呈腫瘤抗原。CCL21又稱次級(jí)淋巴組織趨化因子，能夠趨化樹突細(xì)胞、初始和記憶性T細(xì)胞;CD40配體(CD40 ligand，CD40L)是腫瘤壞死因子家族成員，能夠通過與B細(xì)胞及樹突細(xì)胞表面的CD40相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞表型和功能的成熟，上調(diào)樹突細(xì)胞的共刺激分子和一些輔助因子的表達(dá)，促進(jìn)樹突細(xì)胞成熟。本研究擬構(gòu)建趨化因子CCL21與CD40L融合基因，利用CCL21對(duì)樹突細(xì)胞的趨化活性，將內(nèi)源性樹突細(xì)胞富集于腫瘤部位，CD40L進(jìn)一步活化樹突細(xì)胞，上調(diào)共刺激分子，使得樹突細(xì)胞能夠?qū)⒖乖?肽復(fù)合物呈遞給T、B淋巴細(xì)胞，從而啟動(dòng)細(xì)胞免疫及體液免疫反應(yīng)，兩者協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞C26(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究院)，小鼠樹突細(xì)胞DC2.4(Havard大學(xué) Dana Farber博士惠贈(zèng))，6～8周齡Balb/c小鼠(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所)。

1.2 構(gòu)建 CCL21-exCD40L真核載體［2］CCL21取編碼序列全長(zhǎng)，CD40L取胞外段編碼序列，通過分子生物學(xué)方法，去掉CD40L自身胞內(nèi)段，替換為 CCL21的信號(hào)肽，得到exCD40L。將CCL21與exCD40L作為融合基因的對(duì)照。設(shè)計(jì)引物:P1 TTGGATCCaccatggctcagatgatg;P2 TGCTCGAGTCAGAGTTTGAGTAAGC;P3 CCGCTTCCTCCGCCTCCGCTTCCGCCTCCGCC TTATCCTCTTGAGGGC;P4 GAGGCGGAGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGC CATAGAAGATTGGATAAGGT;其中劃線部分為柔性肽linker，以P1和P3為引物擴(kuò)增CCL21、以P2和P4擴(kuò)增exCD40L，分別擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，以擴(kuò)增后的CCL21和exCD40L互為引物再次PCR擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，即通過linker(GSSSSGSSSSGSSSS)將CCL21與exCD40L連接起來成為一個(gè)融合片段，加入P1和P2繼續(xù)擴(kuò)增，得到CCL21-exCD40L，酶切、連接入真核表達(dá)載體 pcDNA3.1+，共建立 4種質(zhì)粒，即:CCL21-exCD40L、CCL21、exCD40L 及空載體。

1.3 CCL21-exCD40L融合蛋白表達(dá)檢測(cè) 應(yīng)用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+/CCL21-exCD40L至CHO細(xì)胞。取轉(zhuǎn)染后72h細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Western blot檢驗(yàn)。一抗分別為兔抗小鼠CCL21抗體及兔抗小鼠CD40L抗體(Santa cruz公司)，稀釋倍數(shù)1∶200，二抗為山羊抗兔抗體，稀釋倍數(shù)1∶5000，經(jīng)辣根過氧化酶系統(tǒng)顯色，觀察細(xì)胞膜上CCL21-exCD40L的表達(dá)情況。

1.4 CCL21-exCD40L融合蛋白趨化活性檢測(cè)轉(zhuǎn)染CCL21-exCD40L基因到CHO細(xì)胞，以CCL21及空載體為對(duì)照組，72 h后收集上清液。用趨化緩沖液(含 0.5%BSA的 RPMI 1640)調(diào)整 DC2.4細(xì)胞濃度為 2×106/ml，Transwell板上層添加 DC2.4 懸液 50μl，下層添加轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液500，覆蓋孔徑8 μm的多聚碳酸酯膜，置于37℃ 5%二氧化碳孵箱孵育2 h。取出多聚碳酸酯膜，刮去上層表面殘留的細(xì)胞，甲醇固定，再進(jìn)行蘇木精染色，每孔隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)光學(xué)顯微鏡視野(×100)中遷移至多聚碳酸酯膜背面的細(xì)胞總數(shù)。

1.5 CCL21-exCD40L融合蛋白抗腫瘤治療

30只小鼠分別于右側(cè)腋下皮下注射C26細(xì)胞2×106，10d后均形成結(jié)腸癌腫瘤。分為CCL21-exCD40L融合基因組8只，CCL21組、exCD40L組各6只，空載體組、磷酸鹽緩沖液組(PBS組)各5只，各組分別將相關(guān)質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體包裹后腫瘤局部注射給藥，每周注射1次，4周后無痛苦處死小鼠，實(shí)驗(yàn)中死亡的小鼠立即解剖。剝離皮下移植瘤組織測(cè)量體積。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1+/CCL21-exCD40L 真核表達(dá)載體鑒定 CCL21-exCD40L基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖顯示，較明亮的條帶為所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。電泳顯示融合基因大小約1150 bp(見圖1)，與預(yù)期大小相符。重疊PCR過程中引物需多次加入且原產(chǎn)物混雜，電泳圖中可見多條雜帶。將CCL21-exCD40L基因進(jìn)行測(cè)序后，插入 pcDNA3.1+真核表達(dá)載體，經(jīng) HindⅢ/XhoⅠ酶切，在約1100 bp及5400 bp處可見電泳亮帶(圖2)，符合插入的目的片段長(zhǎng)度及切開的 pcDNA3.1+質(zhì)粒 DNA長(zhǎng)度，提示為pcDNA3.1+/CCL21-exCD40L真核表達(dá)載體。

2.2 CCL21-exCD40L融合蛋白表達(dá)測(cè)定 在CCL21一抗標(biāo)記的樣品中檢測(cè)到CCL21(14 kD)及 CCL21-exCD40L(約 45 kD)，CD40L 一抗所標(biāo)記樣品檢測(cè)到 exCD40L(33 kD)及CCL21-exCD40L(約45 kD)，見圖3。

2.3 CCL21-exCD40L融合蛋白趨化活性檢測(cè)光學(xué)顯微鏡下，轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1+/CCL21-exCD40L、pcDNA3.1+/CCL21、pcDNA3.1+的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液中每視野樹突細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)分別為25.87 ±5.49、26.80 ±7.81、1.73±0.96，前兩組間均多于 pcDNA3.1+組(均 P＜ 0.01)，分別是 pcDNA3.1+組的 14.95 和15.49倍;而前兩組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 CCL21-exCD40L抑瘤作用觀察 CCL21-exCD40L融合蛋白抗腫瘤治療后，融合基因組腫瘤均明顯縮小，8只荷瘤小鼠全部存活。各組腫瘤結(jié)節(jié)變化見表1，各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

圖3 Western blot檢測(cè)CHO-融合基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá)Fig.3 The expression ofCCL21-exCD40L protein tested by Western blot

3 討論

樹突細(xì)胞是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原專職遞呈細(xì)胞，能夠捕獲一些通常會(huì)發(fā)生免疫逃避的抗原物質(zhì)(如腫瘤抗原)。未成熟樹突細(xì)胞捕獲腫瘤抗原后可自發(fā)成熟，表達(dá)主要組織相容性抗原復(fù)合物(MHC)及共刺激分子(如CD86和CD40等)，并將其表面MHCⅠ類和Ⅱ類分子上的肽抗原遞呈給T細(xì)胞，使CD8+T細(xì)胞分化成具殺傷能力的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，后者將抗原呈遞給 CD4+細(xì)胞，使其分化成 Th細(xì)胞［3］，從而引發(fā)相應(yīng)的免疫應(yīng)答。然而腫瘤免疫的基礎(chǔ)研究表明，腫瘤細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá)MHC分子及共刺激分子，某些腫瘤細(xì)胞還能分泌產(chǎn)生細(xì)胞因子(如白介素-10)抑制腫瘤患者體內(nèi)樹突細(xì)胞的成熟及機(jī)體的免疫功能，使腫瘤細(xì)胞逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視而無限生長(zhǎng)［4-5］。

CCL21屬于CC類趨化因子，主要表達(dá)于次級(jí)淋巴器官T細(xì)胞區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞。人和小鼠中的CCL21序列高度同源，具有86%的同源性［6］。小鼠 CCL21 具有多種亞型，即 CCL21a、-b和-c，三種 CCL21 的趨化作用基本相似［7］。本實(shí)驗(yàn)中克隆基因?yàn)?CCL21b亞型基因。CCL21通過與其受體CCR7結(jié)合，趨化樹突細(xì)胞、初始和記憶性T細(xì)胞，對(duì)B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及自然殺傷T細(xì)胞也具有趨化作用。既往已有實(shí)驗(yàn)證明CCL21能夠通過募集免疫效應(yīng)細(xì)胞達(dá)到抗腫瘤作用。Sharma等［8］在兩組小鼠肺癌模型中，一組瘤內(nèi)注入CCL21，而對(duì)照組注入緩釋液，發(fā)現(xiàn)注入CCL21組小鼠腫瘤體積明顯縮小，40%的小鼠肺腫瘤明顯消失，而對(duì)照組小鼠的腫瘤迅速生長(zhǎng)，提示CCR7及其配體在抗腫瘤方面具有顯著作用。

表1 各組腫瘤結(jié)節(jié)變化和荷瘤小鼠存活率比較Table 1 Compare the variation of the tumor mass and survival rates between different groups

CD40L屬于共刺激分子的腫瘤壞死因子超家族成員，主要表達(dá)于CD4+T細(xì)胞［9］，其次在嗜堿性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和血小板的表面也可監(jiān)測(cè)到［10］。CD40LCD40的相互作用在胸腺依賴的體液免疫和細(xì)胞免疫調(diào)控中居于重要地位。CD40L通過與B細(xì)胞及樹突細(xì)胞表面的CD40相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞表型和功能的成熟，上調(diào)樹突細(xì)胞的共刺激分子和一些輔助因子的表達(dá)，包括MHCⅡ、CD80、CD86 等，促進(jìn)樹突細(xì)胞分泌 IL-12［11］，這反過來又進(jìn)一步與T細(xì)胞表面的CD28相互作用，誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和活化，誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子如白介素-1、白介素-6、白介素-8、白介素-12、腫瘤壞死因子 α［12］，進(jìn)而誘導(dǎo) CD4+Th細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞上調(diào)其白介素-12受體的表達(dá)，增強(qiáng)由抗CD3抗體誘導(dǎo)的增殖效應(yīng)，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答。

因此如果在腫瘤組織原位分泌CCL21的同時(shí)表達(dá)CD40L，用以活化被趨化來的樹突細(xì)胞，募集CD4+T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞，促進(jìn)趨化而來的免疫效應(yīng)細(xì)胞間相互作用，可以啟動(dòng)免疫應(yīng)答，發(fā)揮特異性抗腫瘤作用。Khaled等［13］將分別負(fù)載CCL21基因及CD40L基因的兩個(gè)腺病毒載轉(zhuǎn)染C26細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染載體的腫瘤局部富集 CD4+、CD8+T細(xì)胞;將兩個(gè)基因同時(shí)于小鼠C26腫瘤模型瘤體原位注射，二者協(xié)同較單基因作用能夠發(fā)揮更強(qiáng)的CD8+T細(xì)胞依賴的抗腫瘤作用，小鼠生存期顯著延長(zhǎng)，證明上述假設(shè)可行。但是實(shí)際應(yīng)用中如果同時(shí)在腫瘤原位分別表達(dá)兩種蛋白，操作步驟繁瑣，不容易推廣。

本研究將CCL21全長(zhǎng)與CD40L胞外區(qū)這兩個(gè)有功能的蛋白的編碼序列連接起來，構(gòu)建融合基因，通過轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，使之分泌表達(dá)CCL21-exCD40L融合蛋白。DC2.4是C57B/L小鼠骨髓來源的不成熟樹突細(xì)胞永生細(xì)胞系，其形態(tài)和生物學(xué)活性與小鼠骨髓來源的樹突細(xì)胞相似［14］，并且用脂多糖及腫瘤壞死因子α刺激后能夠向成熟方向轉(zhuǎn)化，主要用于腫瘤方面的研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，融合蛋白及CCL21蛋白對(duì)樹突細(xì)胞均具有明顯趨化作用，也證明了融合基因中的CCL21這部分基因編碼的蛋白活性能夠正常發(fā)揮，與前人研究結(jié)果［8］相符。

由此我們進(jìn)一步假設(shè)，如果將融合蛋白在腫瘤局部表達(dá)，融合蛋白將發(fā)揮趨化作用募集抗原負(fù)載的樹突細(xì)胞、T及B淋巴細(xì)胞到腫瘤組織，其中的exCD40L部分發(fā)揮其“活化”作用，激活趨化而來的樹突細(xì)胞及B細(xì)胞等，增強(qiáng)免疫細(xì)胞間的正反饋?zhàn)饔?，這樣“趨化”與“活化”相輔相成，協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤的作用。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了小鼠結(jié)腸癌腫瘤模型，當(dāng)腫瘤增大到直徑約0.8 cm左右，用脂質(zhì)體包裹CCL21-exCD40L融合基因腫瘤原位注射，結(jié)果顯示腫瘤體積減小，小鼠生存期延長(zhǎng)，生存率顯著提高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Khaled等一致。證明CCL21-exCD40L融合基因既發(fā)揮了CCL21的趨化作用，又發(fā)揮了CD40L的活化作用，兩者協(xié)同作用大大提高了CCL21或exCD40L作為免疫佐劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。本研究制備的CCL21-exCD40L融合基因轉(zhuǎn)染效率較高，其表達(dá)的蛋白展示有很好的生物活性，但有一定的非特異性免疫反應(yīng)，有待進(jìn)一步改進(jìn)。

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