孫曉譯，相志強(qiáng)，吳 碩，呂媛媛，梁文權(quán)

(1.浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，浙江杭州 310015;2.浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物制劑研究所，浙江杭州 310058）

自1961年靜脈營(yíng)養(yǎng)脂肪乳被用于臨床以來(lái)，由卵磷脂穩(wěn)定的O/W型亞微乳已作為疏水/脂溶性藥物的靜脈治療給藥系統(tǒng)［1］。亞微乳具備物理性能穩(wěn)定、生物相容性好、適于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，它可以解決疏水性/油狀藥物的靜脈給藥問(wèn)題，還可以通過(guò)對(duì)乳劑的進(jìn)一步修飾，達(dá)到靶向給藥、提高藥理活性、減小毒副作用的目的［2］。有關(guān)亞微乳表面修飾對(duì)藥物體內(nèi)動(dòng)力學(xué)的影響和靶向研究較多［3］，細(xì)胞層面研究焦點(diǎn)主要集中在如何提高藥物的細(xì)胞攝取方面［4］。通過(guò)上述研究，人們對(duì)乳劑成分及表面性質(zhì)如何影響藥物攝取有了基本的認(rèn)識(shí)，但系統(tǒng)地比較制劑因素對(duì)亞微乳與細(xì)胞間相互作用特別是胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)過(guò)程的報(bào)道較少。藥物在細(xì)胞中的累積、傳遞和排出直接影響藥效的發(fā)揮和毒副作用的大小，亞微乳可通過(guò)攜載藥物和改變?nèi)榈螛?gòu)成來(lái)影響藥物在細(xì)胞內(nèi)的上述傳遞過(guò)程。研究亞微乳處方因素對(duì)所載藥物細(xì)胞處置的影響對(duì)于處方合理設(shè)計(jì)和制劑制備至關(guān)重要。

本研究選用6-香豆素作為親脂性藥物模型，在以往研究納米給藥系統(tǒng)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)工作的基礎(chǔ)上［5］，考察油相成分、表面活性劑種類、表面電荷對(duì)亞微乳所載藥物細(xì)胞攝取和消除動(dòng)力學(xué)的影響，以期了解乳劑組成在乳滴和細(xì)胞膜相互作用及胞內(nèi)處置過(guò)程中的作用，為亞微乳給藥系統(tǒng)的處方設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 6-香豆素、十八酰胺和氯丙嗪均購(gòu)自美國(guó)Sigma-aldrich公司;注射用大豆油、注射用中鏈油由鐵嶺北亞藥用油有限公司贈(zèng)送;卵磷脂 Lipoid E-80購(gòu)自德國(guó) Lipoid公司;疊氮鈉和2-去氧葡萄糖購(gòu)自比利時(shí)Acros公司;錐蟲藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;甘油、橄欖油、吐溫、司盤和其它試劑均由華東醫(yī)藥公司提供;細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)Promega公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶和青霉素-鏈霉素雙抗(100×)購(gòu)于美國(guó) Gibco公司。人宮頸癌HeLa細(xì)胞系從中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院購(gòu)得。

1.2 6-香豆素亞微乳的制備 將6-香豆素、十八酰胺、司盤類表面活性劑溶于油相(大豆油/橄欖油/中鏈油)，磷脂、甘油及吐溫類表面活性劑溶于注射用水后構(gòu)成水相。油、水兩相加熱至70℃，高速均質(zhì)機(jī)制成初乳。微射流15000、PSI 5～10個(gè)循環(huán)制備亞微乳。將乳劑定容后，調(diào)節(jié) pH 至7.4，過(guò)0.45 μm 濾膜，通氮?dú)夤喾狻?15℃高壓滅菌30 min。具體亞微乳處方見(jiàn)表1。

表1 亞微乳處方組成Table 1 Formulations of sub-micro emulsions

1.3 亞微乳表征分析 取亞微乳，用PBS稀釋至合適濃度，激光衍射粒度分析儀測(cè)定粒徑分布和表面電位。透析法(MWCO:14 kDa)測(cè)定亞微乳的體外釋放。透析液為含0.5%吐溫80的PBS。37℃，75次/min振搖條件下，間隔一定時(shí)間取樣。樣品于λex=456 nm和λem=504 nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算6-香豆素濃度。

1.4 細(xì)胞攝取以及內(nèi)吞抑制實(shí)驗(yàn) HeLa細(xì)胞(1×105個(gè)/孔)接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過(guò)夜后，加入亞微乳使6-香豆素終濃度為1μg/ml。2 h后，吸去培養(yǎng)液，滴入4 mg/ml錐蟲藍(lán)后再以PBS洗滌細(xì)胞，去除游離熒光。加入200μl細(xì)胞裂解液，收集裂解物測(cè)定藥物濃度(λex=456 nm，λem=504 nm)［6］并根據(jù)試劑盒步驟以BCA法測(cè)定蛋白含量。胞內(nèi)藥物含量以每微克蛋白含6-香豆素藥量表示。攝取動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)加入亞微乳使6-香豆素濃度為100 ng/ml，分別于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)吸去培養(yǎng)液，洗滌細(xì)胞、錐蟲藍(lán)處理，收集細(xì)胞裂解樣品用于含量測(cè)定。

將1×105細(xì)胞接種于24孔板中，過(guò)夜貼壁生長(zhǎng)后加入內(nèi)吞抑制劑。各抑制組分別加入50 mmol/L 2-去氧葡萄糖+10 mmol/L疊氮鈉、0.45 mol/L 蔗糖和 10μg/ml氯丙嗪預(yù)先處理30 min。在抑制劑存在的條件下，加入6-香豆素亞微乳，攝取30 min。按細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作裂解細(xì)胞，測(cè)定藥物含量。

1.5 攝取動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算 假設(shè)在胞外藥物濃度為C0的情況下，6-香豆素以一級(jí)速率常數(shù)k'進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)以一級(jí)速率常數(shù)k消除，C為胞內(nèi)藥物濃度，則其動(dòng)力學(xué)方程可表示為:

由于在攝取過(guò)程中C0幾乎恒定，可將k'C0定義為新的復(fù)合參數(shù)k0，表示在本實(shí)驗(yàn)孵育濃度下(100 ng/ml)的細(xì)胞攝取速率。根據(jù)靜脈滴注一室模型，將式(1)進(jìn)行拉氏變換后得式(2)。使用OriginPro 8軟件將攝取數(shù)據(jù)按(2)式進(jìn)行非線性回歸。細(xì)胞內(nèi)藥物穩(wěn)態(tài)濃度C∞根據(jù)(3)式計(jì)算［7］。

2 結(jié)果

2.1 6-香豆素亞微乳的表征 各處方亞微乳粒徑控制在180～230 nm。油相種類改變或表面活性劑修飾(吐溫或司盤)未對(duì)乳滴zeta電位帶來(lái)顯著影響，表面電位-20 mV左右。為觀察細(xì)胞培養(yǎng)液中血清對(duì)乳劑穩(wěn)定性的影響，我們選用未經(jīng)修飾的大豆油為油相的亞微乳作為陰離子乳劑代表，與陽(yáng)離子亞微乳(十八酰胺亞微乳)進(jìn)行比較，測(cè)定了血清孵育前后乳滴粒徑和電位變化。結(jié)果表明，陰離子乳劑粒徑和電位無(wú)顯著性變化，陽(yáng)離子乳劑粒徑顯著增大，電位由正轉(zhuǎn)負(fù)(表2)。

表2 6-香豆素陰離子乳劑和陽(yáng)離子乳劑粒徑與電位Table 2 Size and zeta potential of 6-coumarin loaded anionic and cationic sub-micro emulsions

圖1是大豆油亞微乳和十八酰胺亞微乳的體外釋放曲線。24 h內(nèi)兩種乳劑的釋放均未超過(guò)20%。陽(yáng)離子成分的加入不影響乳劑釋放行為。

圖1 6-香豆素陰離子和陽(yáng)離子亞微乳體外釋放曲線Fig.1 In vitro release of 6-coumarin anionic/cationic sub-micro emulsions

2.2 油相種類對(duì)細(xì)胞攝取的影響 以常用油相大豆油、中鏈油和橄欖油分別制備6-香豆素亞微乳，經(jīng)過(guò)2 h的攝取后，各組細(xì)胞內(nèi)6-香豆素含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2 油相種類對(duì)胞內(nèi)6-香豆素含量的影響Fig.2 The effects of oil components on cellular level of 6-coumarin

2.3 表面活性劑修飾對(duì)細(xì)胞攝取的影響 以不同HLB值(1.8～16.7)的非離子型表面活性劑司盤系列和吐溫系列作為輔助乳化劑修飾帶負(fù)電荷的大豆油亞微乳，觀察乳劑表面親水或疏水特性對(duì)細(xì)胞攝取的影響。在細(xì)胞攝取過(guò)程中，未發(fā)現(xiàn)由非離子表面活性劑加入造成的細(xì)胞毒性。使用吐溫20、吐溫40、吐溫80、吐溫85修飾后，胞內(nèi)6-香豆素水平分別為每微克蛋白含(34.08 ±2.99)、(32.76 ±1.09)、(33.33±2.56)和(36.18 ±2.76)ng 6-香豆素。司盤20、司盤60、司盤80和司盤85修飾的亞微乳細(xì)胞數(shù)攝取水平分別為:每微克蛋白含(46.09±1.98)、(43.56 ± 0.50)、(40.77 ± 0.14)和(37.84 ±3.71)ng 6-香豆素。與對(duì)照組大豆油亞微乳［(38.54 ±0.34)ng/μg蛋白］相比，以相對(duì)HLB較低的司盤修飾乳劑可在一定程度上增加細(xì)胞的攝取，經(jīng)司盤20、司盤60和司盤80修飾后，胞內(nèi)6-香豆素水平顯著提高(P ＜0.05)。其中司盤 20的增效作用最強(qiáng)。但用吐溫系列(較高HLB值)修飾的亞微乳細(xì)胞攝取與對(duì)照相差異無(wú)顯著性意義，吐溫40甚至降低了胞內(nèi)藥物濃度。我們以對(duì)照組胞內(nèi)藥物濃度為分母，表面活性劑修飾組胞內(nèi)6-香豆素濃度為分子，計(jì)算各組攝取增效倍數(shù)。圖3是輔助表面活性劑HLB值與攝取增效倍數(shù)之間的關(guān)系。

圖3 表面活性劑HLB值與細(xì)胞攝取增效倍數(shù)的關(guān)系Fig.3 The relationship between HLB and uptake enhancement rate

2.4 表面電荷對(duì)細(xì)胞攝取動(dòng)力學(xué)的影響 以十八酰胺修飾后得陽(yáng)離子亞微乳，其細(xì)胞攝取動(dòng)力學(xué)曲線如圖4所示。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件下，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性。隨時(shí)間延長(zhǎng)，胞內(nèi)藥物濃度逐漸增加，至1.5 h時(shí)攝取達(dá)到飽和。陽(yáng)離子亞微乳組的胞內(nèi)藥物濃度顯著高于陰離子乳劑，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)胞內(nèi)濃度陽(yáng)離子組約為陰離子組的3倍。

圖4 陰離子亞微乳和陽(yáng)離子亞微乳細(xì)胞攝取動(dòng)力學(xué)Fig.4 Cellular uptake kinetics of anionic/cationic sub-micro emulsions

細(xì)胞攝取動(dòng)力學(xué)過(guò)程經(jīng)非線性回歸后得回歸方程，R2均 ＞0.95，P ＜0.01。動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表3)顯示陽(yáng)離子亞微乳組的攝取速率常數(shù)(P ＜0.01)和消除速率常數(shù) k(P ＜0.05)均顯著高于陰離子亞微乳組，胞內(nèi)藥物穩(wěn)態(tài)濃度C∞約為后者的3倍，與實(shí)測(cè)結(jié)果一致。

表3 陰離子亞微乳和陽(yáng)離子亞微乳6-香豆素?cái)z取及消除動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Uptake and elimination kinetic parameters of 6-coumarin delivered by anionic and cationic emulsions

2.5 表面電荷對(duì)藥物入胞途徑的影響 為進(jìn)一步闡明陽(yáng)離子亞微乳如何增加細(xì)胞攝取的原因，我們使用了能量抑制劑和clathrin依賴的內(nèi)吞途徑抑制劑對(duì)陽(yáng)離子乳劑攝取途徑進(jìn)行了初步考察。結(jié)果顯示幾種抑制劑對(duì)陽(yáng)離子亞微乳的細(xì)胞攝取均沒(méi)有抑制作用，陰離子亞微乳攝取有所降低，見(jiàn)表4。

表4 不同抑制劑對(duì)陰離子亞微乳和陽(yáng)離子亞微乳攝取后胞內(nèi)6-香豆素水平變化Table 4 The effects of endocytosis inhibitors on anionic/cationic sub-micro emulsions uptake

3 討論

亞微乳處方因素可影響其與細(xì)胞膜的相互作用及后續(xù)的胞內(nèi)處置過(guò)程。油相是乳劑重要的構(gòu)成部分，它為疏水性藥物的包載提供了一個(gè)親脂內(nèi)核。油相種類的差別可直接影響乳劑的物理穩(wěn)定性［8］。植物油由長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油三酯的混合物構(gòu)成，如大豆油、橄欖油、玉米油、棉籽油等通常單獨(dú)或混合作為脂肪乳的油相。但有些疏水性藥物在長(zhǎng)鏈油中的溶解度不高，于是人們嘗試使用中鏈油來(lái)解決載藥量的問(wèn)題。因此，有必要知道油相種類的替換是否會(huì)影響乳劑和細(xì)胞的相互作用。本研究采用6-香豆素作為親脂性藥物模型(LogP=6.9)，代表負(fù)載于亞微乳中藥物的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)行為。以具不同溶解6-香豆素能力的大豆油(617±6)μg/ml、中鏈油(990 ±34)μg/ml和橄欖油(873 ±14)μg/ml作為亞微乳油相，考察它們對(duì)細(xì)胞攝取的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這三類中性油種類的改變對(duì)胞內(nèi)藥物攝取水平無(wú)顯著影響。

表面活性劑在亞微乳的形成中起重要作用，同時(shí)也決定了乳滴表面的物理化學(xué)性質(zhì)。乳劑界面的疏水特性在乳滴與細(xì)胞的相互作用中起重要作用。Liu［9］等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的粘附和吞噬與物體表面疏水性高度相關(guān)。Koqa［10］的研究結(jié)果也表明，藥物的腸道攝取水平與表面活性劑HLB值呈負(fù)相關(guān)。以親水性或疏水性的表面活性劑修飾卵磷脂包裹的油滴表面，可能造成界面膜流動(dòng)性的改變，引起藥物在油滴內(nèi)部和油滴表面的重新分配，影響乳滴與細(xì)胞的相互作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物攝取不完全符合疏水性規(guī)律:隨HLB值的增高，細(xì)胞攝取變少。在司盤系列中，HLB值最高的司盤20細(xì)胞攝取最高，而HLB最小的司盤85和對(duì)照組的攝取相當(dāng)。HLB較高的吐溫系列不增加胞內(nèi)藥物水平，甚至有所降低。這提示表面適當(dāng)?shù)氖杷匦杂欣谠黾蛹?xì)胞攝取。如果界面疏水性太強(qiáng)可能會(huì)阻礙乳滴接近細(xì)胞表面。若親水性太強(qiáng)也對(duì)細(xì)胞膜吸附和攝取不利，這是司盤增加細(xì)胞攝取的主要原因。另外，與吐溫相比，司盤可擾亂細(xì)胞磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜去穩(wěn)定化，從而促進(jìn)藥物攝取。我們用非離子表面活性劑修飾非病毒類基因載體時(shí)，也發(fā)現(xiàn)具備合適HLB值的司盤可促進(jìn)基因的攝取和轉(zhuǎn)染［11］。

亞乳劑組成成分(如表面活性劑HLB值、油相組成)中，電荷對(duì)細(xì)胞攝取影響最大。十八酰胺是一類常用的陽(yáng)離子脂質(zhì)。以其修飾的陽(yáng)離子乳滴可在生理?xiàng)l件下與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜發(fā)生靜電作用，從而產(chǎn)生非特異性吸附，增加載體與細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)吞途徑［12-13］，進(jìn)而增加藥物的細(xì)胞攝取。其攝取增效作用是上述討論的處方因素中最強(qiáng)的。

為進(jìn)一步明確陽(yáng)離子亞微乳是通過(guò)何途徑增加HeLa細(xì)胞對(duì)6-香豆素的攝取，我們進(jìn)行了內(nèi)吞抑制實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示能量抑制劑和clathrin依賴的內(nèi)吞途徑抑制劑對(duì)陽(yáng)離子亞微乳攝取沒(méi)有顯著抑制作用，陰離子亞微乳攝取有所降低。由于陽(yáng)離子成分可增加乳滴的細(xì)胞膜特異性吸附，且6-香豆素有較強(qiáng)的跨膜能力，因此陽(yáng)離子乳劑主要通過(guò)增加乳滴接觸細(xì)胞膜機(jī)會(huì)將6-香豆素分配至細(xì)胞中，Xu等［14］在PLGA納米粒入胞機(jī)制研究中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。陽(yáng)離子亞微乳的細(xì)胞攝取過(guò)程中，內(nèi)吞的百分率可忽略，因此內(nèi)吞抑制劑對(duì)細(xì)胞攝取沒(méi)有顯著抑制作用，同時(shí)值得注意的是它的消除速率常數(shù)大于陰離子組，我們推測(cè)這與攝取途徑相關(guān)。從內(nèi)吞抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，陰離子亞微乳近30%胞內(nèi)藥物是通過(guò)乳劑的內(nèi)吞獲得的。這個(gè)不大的百分率可能會(huì)帶來(lái)后續(xù)消除過(guò)程中較大的差異。兩親性蛋白對(duì)6-香豆素有增溶作用(預(yù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)得10%小牛血清可提高6-香豆素溶解度80倍)，被內(nèi)吞入胞的乳滴首先在胞內(nèi)濃縮的高蛋白環(huán)境下釋放藥物，然后藥物再根據(jù)濃度梯度擴(kuò)散回細(xì)胞外液，這就比陽(yáng)離子乳劑組中藥物直接從胞內(nèi)擴(kuò)散至培養(yǎng)液的速度慢。另外，乳滴的外排也可能是引起陰離子乳劑組消除速率常數(shù)小的另一個(gè)原因。通過(guò)clathrin介導(dǎo)入胞的部分陰離子乳滴會(huì)通過(guò)胞吐被外排［15］，與擴(kuò)散原理引起的消除過(guò)程相比，胞吐是一個(gè)能量依賴且速度較慢的過(guò)程［16］。而陽(yáng)離子亞微乳中游離藥物以分子形式入胞后直接被外排，導(dǎo)致在細(xì)胞消除動(dòng)力學(xué)中陽(yáng)離子亞微乳的胞內(nèi)滯留能力稍弱于陰離子組。

綜上所述，本研究系統(tǒng)考察了亞微乳處方因素對(duì)6-香豆素的細(xì)胞攝取和胞內(nèi)處置過(guò)程產(chǎn)生的影響。乳化劑種類可顯著影響藥物的細(xì)胞攝取，以較低HLB值的表面活性劑司盤系列作為表面修飾有助于提高胞內(nèi)藥物水平，其中以司盤20效果最好。陽(yáng)離子亞微乳通過(guò)增加與細(xì)胞膜接觸的機(jī)會(huì)，可大幅度增加細(xì)胞攝取;但其與陰離子亞微乳相比，藥物的細(xì)胞滯留時(shí)間縮短。以上結(jié)果提示我們進(jìn)行亞微乳處方設(shè)計(jì)時(shí)，可通過(guò)選用具備合適HLB值的表面活性劑和調(diào)整表面電荷性質(zhì)，增加細(xì)胞攝取及細(xì)胞內(nèi)存留能力。

［1］HIPPALGAONKAR K，MAJUMDAR S，KANSARA V.Injectable lipid emulsions-advancements，opportunities and challenges［J］.AAPS Pharm Sci Tech，2010，11(4):1526-1540.

［2］TAMILVANAN S.Formulation of multifunctional oil-in-water nanosized emulsions for active and passive targeting of drugs to otherwise inaccessible internal organs of the human body ［J］.Int J Pharm，2009，381(1):62-76.

［3］LU Y，QI J，WU W.Absorption，disposition and pharmacokinetics ofnanoemulsions ［J］.Curr Drug Metab，2012，13(4):396-417.

［4］LEE K C，MATURO C，RODRIGUEZ R，et al.Nanomedicine-nanoemulsion formulation improves safety and efficacy of the anti-cancer drug paclitaxel according to preclinical assessment［J］.J Nanosci Nanotechnol，2011，11(8):6642-6656.

［5］SUN X Y，LIANG W Q(孫曉譯，梁文權(quán)).Comparison on antitumor activity of cisplatin-loaded liposomes and nanoparticles in vitro［J］.Journal of Zhejiang University(Medical Sciences)(浙江大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版)，2011，40(4):408-413.

［6］SUN X Y，LI F，WANG Y，et al.Cellular uptake and elimiantion of lipophilic drug delivered by nanocarriers［J］.Pharmazie，2010，65(10):737-742.

［7］CHEN J，SUN X，YU Z，et al.Influence of lipid components on gene delivery by polycation liposomes:Transfection efficiency，intracellular kinetics and in vivo tumor inhibition ［J］.Int J Pharm，2012，422(1-2):510-515.

［8］HUANG C F，F(xiàn)ANG C L，LIAO M H，et al.The effect of oil components on the physicochemical properties and drug delivery of emulsions:tocol emulsion versus lipid emulsion［J］.Int J Pharm，2007，335(1-2):193-202.

［9］LIU Y，YANG S F，LI Y，et al.The influence of cell and substratum surface hydrophobicities on microbial attachment［J］.J Biotechnol，2004，110(3):251-256.

［10］KOQAK，MURAKAMIM，KAWASHIMAS.Modification of ceftibuten transport by changes in lipid fluidity caused by fatty acid glycerol esters［J］.Biol Pharm Bull，1999，22(1):103-106.

［11］HUANG Y Z，GAO J Q，CHEN J L，et al.Cationic liposomes modified with non-ionic surfactants as effective non-viral carrier for gene transfer［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2006，49(2):158-164.

［12］GOLDSTEIN D，SADER O，BENITA S.Influence of oil droplet surface charge on the performance of antibody--emulsion conjugates ［J］.Biomed Pharmacother，2007，61(1):97-103.

［13］KUO Y C，CHEN H H.Effect of electromagnetic field on endocytosis ofcationic solid lipid nanoparticles by human brain-microvascular endothelial cells ［J］.J Drug Target，2010，18(6):447-456.

［14］XU P，GULLOTTI E，TONG L，et al.Intracellular drug delivery by poly(lactic-co-glycolic acid)nanoparticles，revisited ［J］.Mol Pharm，2009，6(1):190-201.

［15］PARK J S，HAN T H，LEE K Y，et al.N-acetyl histidine-conjugated glycol chitosan self-assembled nanoparticles for intracytoplasmic delivery of drugs:endocytosis，exocytosis and drug release［J］.J Control Release，2006，115(1):37-45.

［16］PANYAM J，LABHASETWAR V.Dynamics of endocytosis and exocytosis of poly(D，L-lactide-coglycolide)nanoparticles in vascular smooth muscle cells［J］.Pharm Res，2003，20(2):212-220.