張 軍，張國新，陳菲菲，何邦順，葉 峰，潘曉林

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院消化科，南京市第一醫(yī)院消化科，江蘇南京 210006;2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科，江蘇南京 210029）

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)定植于人體胃黏膜表面，其感染與胃十二指腸疾病的發(fā)生密切相關(guān)［1］。Hp脂多糖是Hp的致病因子之一，在Hp感染相關(guān)的疾病中起重要作用。胃上皮細(xì)胞完整性的破壞大多數(shù)是通過Hp表面脂多糖減弱粘膜細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白間的相互作用而發(fā)生的［2］。Sonic Hedgehog(Shh)信號(hào)通路在維持成熟組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，慢性炎癥的組織修復(fù)和癌癥發(fā)生等多種進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用［3］。Nishizawa 等［4］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Hp感染形成胃黏膜慢性炎癥或萎縮時(shí)，Shh表達(dá)下降;早期根除Hp，Shh表達(dá)可恢復(fù)正常。Lee等［5］研究發(fā)現(xiàn)，伴 Hp感染的胃癌中，Shh表達(dá)明顯上升?？梢?，Hp感染對(duì)Shh信號(hào)通路的表達(dá)有影響作用，但是目前Hp與Shh信號(hào)通路之間相互作用的具體機(jī)制尚未明確。本研究旨在通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，選擇Hp的毒力因子脂多糖作為刺激因子，觀察脂多糖刺激后Shh信號(hào)通路中相關(guān)蛋白Gli、Ptch-1的表達(dá)情況，從而探討Hp脂多糖對(duì)該信號(hào)通路的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1由南京市第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供并保存。Hp菌株26695由江蘇省人民醫(yī)院饋贈(zèng)。鱟試劑購于廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠。Gli、Ptch-1抗體均購自cell signal公司，噻唑藍(lán)(MTT)購自美國Sigma公司。

1.2 Hp培養(yǎng) 在微需氧環(huán)境中，37℃培養(yǎng)，厭氧孵箱內(nèi)放置少量的水以保持濕度，氣體交換使箱內(nèi)氣體氧氣、二氧化碳、氮?dú)獾馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、85%。將菌種(Hp26695)接種于哥倫比亞培養(yǎng)基(加入10%的脫纖維羊血)，逐日觀察培養(yǎng)基中細(xì)菌菌落的特征及顯微鏡下細(xì)菌的形態(tài)特點(diǎn)。培養(yǎng)72h后觀察菌落呈無色半透明，針尖樣大小，并經(jīng)快速尿素酶試驗(yàn)判定陽性，提示培養(yǎng)的細(xì)菌為Hp。

1.3 Hp脂多糖的制備 參考Luo［6］的熱酚水法提取出Hp脂多糖，經(jīng)動(dòng)態(tài)比濁法證實(shí)為內(nèi)毒素，并且測得其濃度為1.062×105EU/ml(1 ng=2.5 EU)，即最后提取出Hp脂多糖濃度為42.48μg/ml。

1.4 GES-1細(xì)胞培養(yǎng)和分組 常規(guī)復(fù)蘇GES-1細(xì)胞后，使用高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，pH 7.4)，于含 50 ml/l二氧化碳的37℃、飽和濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，約48 h換液一次，細(xì)胞生長至覆蓋約70% ～80%培養(yǎng)瓶底面時(shí)按1∶3比例傳代。預(yù)實(shí)驗(yàn)除用無Hp脂多糖刺激的GES-1細(xì)胞做陰性對(duì)照外，分別用 Hp 脂多糖濃度 0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml刺激GES-1細(xì)胞，采用Western Blot法檢測Shh信號(hào)通路中Ptch-1蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Hp脂多糖濃度為1μg/ml時(shí)Ptch-1蛋白開始較陰性對(duì)照組表達(dá)降低，考慮Hp脂多糖濃度為1μg/ml為最低有效刺激濃度。在此預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)分6組，分別為陰性對(duì)照組、脂多糖 1μg/ml干預(yù)組、10μg/ml干預(yù)組、20μg/ml干預(yù)組、30μg/ml干預(yù)組、40μg/ml干預(yù)組。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖 將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，450×g離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，往細(xì)胞沉淀中加入高糖DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μl，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化后分別加入不同濃度Hp脂多糖，同時(shí)設(shè)不加脂多糖的陰性對(duì)照組以及只加入培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜而無GES-1細(xì)胞的調(diào)零孔。培養(yǎng)24 h后，加入5%MTT 10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，室溫震蕩10 min溶解。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，以490 nm為測定波長，用酶標(biāo)儀檢測吸光度值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率=(陰性對(duì)照孔吸光度值-加Hp脂多糖孔吸光度值)/(陰性對(duì)照組吸光度值)×100%。

1.6 Western Blot法檢測 Gli、Ptch-1 蛋白水平取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于6孔板，分別加3 ml不同濃度脂多糖，培養(yǎng)24 h后加入蛋白裂解液，得到全蛋白提取物，Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測定。提取的蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混合后，煮沸5 min。進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入一抗，4℃過夜。TBST洗4次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫作用2 h，再次用TBST洗膜，然后使用ECL法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)照相并分析處理。上述反應(yīng)以β-actin作為內(nèi)參照，結(jié)果用Alphalmager TM 2200圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片掃描并進(jìn)行平均灰度值(average density values，ADV)測定，以 ADV Gli、Ptch-1/ADV β-actin的比值作為各組產(chǎn)物相對(duì)表達(dá)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，多組樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析;變量間相關(guān)分析用Person相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp脂多糖對(duì)GES-1細(xì)胞增殖的影響 在倒置相差顯微鏡下可以觀察到，經(jīng)Hp脂多糖刺激后細(xì)胞形態(tài)變圓，分布變稀疏，高濃度組甚至可見到細(xì)胞崩解后的碎片、顆粒等;而陰性對(duì)照組GES-1細(xì)胞貼壁良好，輪廓清晰。不同濃度Hp脂多糖刺激組的細(xì)胞增殖抑制均較陰性對(duì)照組增強(qiáng)(均P＜0.05)，見圖1。并且隨著Hp脂多糖濃度增加，其對(duì)GES-1細(xì)胞增殖抑制越強(qiáng)，兩者呈正相關(guān)(r=0.985，P ＜0.001)，見圖2。提示Hp脂多糖可以抑制GES-1細(xì)胞生長。

圖1 不同濃度Hp脂多糖對(duì)GES-1細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effectsofHp-LPS with different concentrations on GES-1 cell growth

圖2 Hp脂多糖濃度與GES-1細(xì)胞增殖抑制的相關(guān)性分析Fig.2 The relation between the concentrations of Hp-LPS and the inhibition rates of GES-1 cell growth

2.2 Hp脂多糖對(duì)GES-1細(xì)胞Shh信號(hào)通路相關(guān)蛋白Gli、Ptch-1表達(dá)的影響 圖3為Hp脂多糖干預(yù)各組Gli、Ptch-1蛋白表達(dá)的Western Blot結(jié)果。表1、圖4為蛋白 Gli/β-actin、Ptch-1/β-actin比值分析數(shù)據(jù)及柱狀圖。結(jié)果顯示不同濃度Hp脂多糖Gli、Ptch-1蛋白的相對(duì)表達(dá)較陰性對(duì)照組均降低(均P＜0.05)。將Hp脂多糖濃度與Gli蛋白相對(duì)表達(dá)值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果兩者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.945，P＜0.001);將Hp脂多糖濃度與Ptch-1蛋白相對(duì)表達(dá)值進(jìn)行相關(guān)性分析，兩者也呈負(fù)相關(guān)(r=-0.985，P ＜0.001)，說明隨著 Hp 脂多糖濃度的升高，GES-1細(xì)胞中Shh信號(hào)通路相關(guān)蛋白Ptch-1、Gli的表達(dá)量逐漸減少，見圖5。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染后首先是引起慢性炎癥，進(jìn)而發(fā)生胃黏膜萎縮、腸上皮化生、不典型增生、最終導(dǎo)致癌變［7-8］。然而，Hp確切的致病機(jī)制至今還不是很清楚。

Hp的致病因子分兩類:一類是定植因子，如鞭毛、適應(yīng)性的酶和蛋白等;另一類是毒力因子，它能使機(jī)體產(chǎn)生炎癥和免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致一系列疾病的形成。脂多糖是Hp的毒力因子之一，在Hp感染及Hp相關(guān)疾病中起重要作用。Hp脂多糖能介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，從而介導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生［9-10］。

圖3 Western Blot法檢測GES-1細(xì)胞中Gli、Ptch-1蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.3 The expression of Gli and Ptch-1 proteins in GES-1 cells detected by Western Blot

表1 不同濃度Hp脂多糖作用下GES-1細(xì)胞中 Gli/β-actin、Ptch-1/β-actin 比值比較Table 1 The comparison of Gli protein/β-actin and Ptch-1 protein/β-actin ratios in GES-1 cells after treatment of Hp-LPS with different concentrations

Shh信號(hào)通路是調(diào)節(jié)昆蟲和脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的經(jīng)典通路之一。主要由分泌型信號(hào)蛋白Shh配體、跨膜蛋白受體Ptch(Ptch1、Ptch2)和另一跨膜蛋白Smo以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白(Gli1、Gli2、Gli3)組成［11］。一般認(rèn)為在缺乏Shh配體信號(hào)的刺激下，Ptch與Smo結(jié)合，Ptch抑制Smo的活性，此時(shí)該信號(hào)通路處于失活狀態(tài);而當(dāng)Shh配體存在時(shí)，Shh配體與跨膜蛋白受體Ptch結(jié)合后，解除了Ptch對(duì)Smo的抑制，Smo進(jìn)入胞質(zhì)中，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的下傳，激活轉(zhuǎn)錄因子Gli，Gli以全長的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，將細(xì)胞外的Shh信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，從而調(diào)控細(xì)胞的生長發(fā)育［12］。

Suzuki等［13］研究發(fā)現(xiàn)，蒙古沙鼠在 Hp 感染51周后，Shh基因的表達(dá)明顯下降，而且該基因的表達(dá)與壁細(xì)胞的丟失及腺頸部細(xì)胞的分化受阻呈正相關(guān)。在Hp感染陽性患者中，Shh表達(dá)亦顯著下調(diào)，而且該蛋白表達(dá)下調(diào)與萎縮及腸化病變嚴(yán)重程度之間存在顯著正相關(guān)［14］。可見，Hp感染對(duì)Shh信號(hào)通路的表達(dá)有影響作用，但是目前Hp與Shh信號(hào)通路之間的具體作用機(jī)制尚未明確，其通過何種毒力因子造成Shh信號(hào)通路中相關(guān)成員的表達(dá)發(fā)生變化仍然不確定。Piotrowski等［15］觀察了從 Hp中提取的脂多糖對(duì)胃上皮細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)脂多糖能夠引起胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡的顯著增加，且凋亡指數(shù)與胃炎的嚴(yán)重程度及脂多糖的劑量有關(guān)。而本次實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果提示Hp脂多糖可以抑制GES-1細(xì)胞活性，且隨著Hp脂多糖濃度增加，其抑制能力增強(qiáng)，這與Piotrowski等的研究結(jié)果一致，但其機(jī)制尚不明確。脂多糖對(duì)巨噬細(xì)胞及胃粘膜細(xì)胞有強(qiáng)大的激活作用，釋放多種炎性細(xì)胞因子。研究顯示Hp脂多糖能激活NF-κB，從而引起多種細(xì)胞因子合成和釋放［16］。Kim 等［17］在人胃癌細(xì)胞株(AGS)中用一種特殊的抑制劑抑制NF-κB的激活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Shh的表達(dá)也受到抑制。Yang等［18］研究證實(shí)，在肺小血管上皮細(xì)胞中細(xì)菌脂多糖能影響Shh信號(hào)通路的表達(dá)。這些研究均提示Hp脂多糖可能是通過NF-κB等因子影響Shh信號(hào)通路表達(dá)。

因此本研究選擇Hp脂多糖作為刺激因子，探討Hp脂多糖與Shh信號(hào)通路之間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)用不同濃度的Hp脂多糖刺激GES-1細(xì)胞后，Shh信號(hào)通路中相關(guān)蛋白Gli與Ptch-1的表達(dá)均較陰性對(duì)照組明顯降低，且隨著Hp脂多糖濃度的增加，其對(duì)Shh信號(hào)通路相關(guān)蛋白Gli、Ptch-1的抑制能力增強(qiáng)。本研究提示Hp感染后可能通過脂多糖抑制了Shh信號(hào)通路，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，并導(dǎo)致細(xì)胞的增殖抑制;隨著Hp脂多糖濃度增加，Shh信號(hào)通路相關(guān)成員表達(dá)逐漸降低，GES-1細(xì)胞損傷逐漸加重。我們推測可能是隨著Hp脂多糖濃度增加，更多Shh信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)被抑制，細(xì)胞損傷隨之加重。

近年來很多研究顯示Shh信號(hào)通路與消化道腫瘤如胃癌關(guān)系也十分密切［14，19］。WHO 已將Hp定為胃癌的第一類致癌因子，因此有必要進(jìn)一步在胃癌細(xì)胞中觀察Hp脂多糖對(duì)Shh信號(hào)通路的影響。此外本研究主要通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察到Hp脂多糖能影響Shh信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上可進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以探討體內(nèi)環(huán)境下Hp脂多糖與Shh信號(hào)通路兩者的相互關(guān)系。

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