張英展 周應(yīng)畢 劉斌

隨著人們生活水平的不斷提高，心血管疾病發(fā)病率迅速升高[1]。其中，高血壓病已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病之一。血管內(nèi)皮的舒張功能異常會(huì)增加外周血管阻力，在高血壓的發(fā)病過程中血管內(nèi)皮的舒縮功能異常起到重要作用。普遍認(rèn)為，血管及其內(nèi)皮所產(chǎn)生的一系列生化因子維持和調(diào)節(jié)著血管舒張或收縮反應(yīng)[2]。等長收縮法離體張力實(shí)驗(yàn)?zāi)芎芎玫胤从逞艿纳炜s效應(yīng)[3]。目前，各種小鼠疾病模型和基因敲除小鼠廣泛應(yīng)用于心血管疾病研究，但現(xiàn)階段離體張力實(shí)驗(yàn)普遍用于檢測大管徑血管，國內(nèi)對(duì)檢測小鼠小管徑阻力血管少見報(bào)道[4-5]。因此，本實(shí)驗(yàn)將建立一種用等長收縮法測定小鼠腸系膜動(dòng)脈血管舒縮效應(yīng)的方法，為檢測小鼠腸系膜動(dòng)脈張力變化提供直觀、可靠的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)C57BL/6成年雄性小鼠（南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，中國）；試劑：花生四烯酸鈉鹽（AA）、N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（L-NAME）、苯腎上腺素（PE）、乙酰膽堿（ACh），上述試劑均來自美國sigma公司；重要溶液的配制：生理鹽溶液（PSS）：其成分為123 mmol/L氯化鈉，4.7 mmol/L氯化鉀，15.5 mmol/L碳酸氫鈉，1.2 mmol/L磷酸二氫鉀，1.2 mmol/L硫酸鎂，1.25 mmol/L氯化鈣，以及11.5 mmol/L葡萄糖；含60 mmol/L氯化鉀的PSS（K+-PSS）：含67.7 mmol/L氯化鈉，60 mmol/L氯化鉀，其他成分同PSS。儀器：壓力傳感器（AE801，Kronex公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 血管環(huán)的制備 取C57BL/6小鼠腸系膜動(dòng)脈并置于生理鹽溶液（PSS）中，剝離血管周圍脂肪和結(jié)締組織，并將動(dòng)脈橫切成1.0 mm長的血管環(huán)。

1.2.2 靜息血管環(huán)張力校正 在體視顯微鏡下，于裝有PSS的37 ℃恒溫水浴槽內(nèi)，將血管環(huán)安裝在兩根直徑為50 μm的鎢絲間。其中一根鎢絲固定，而另一根與微力傳感器相連，數(shù)據(jù)經(jīng)橋式放大器后連入PowerLab進(jìn)行采集和處理。血管環(huán)的前負(fù)荷通過遞增法調(diào)至最適水平（1.0 mm小鼠腸系膜動(dòng)脈環(huán)約250 mg）。實(shí)驗(yàn)時(shí)血管環(huán)先用60 mmol/L的K+-PSS溶液預(yù)收縮，每隔15 min 1次，直至其對(duì)K+-PSS的反應(yīng)達(dá)到最佳且可重復(fù)。

1.2.3 血管環(huán)張力監(jiān)測 在有或無一氧化氮合酶（NOS）抑制劑（L-NAME）的情況下，加入苯腎上腺素（PE）預(yù)收縮，平衡10 min后，使血管張力達(dá)到最高值，再加入相應(yīng)的刺激物，實(shí)時(shí)記錄血管環(huán)張力結(jié)果。其舒張強(qiáng)度以降低苯腎上腺素誘發(fā)收縮的百分比來表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用PEMS 3.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料使用字2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測乙酰膽堿對(duì)血管環(huán)的舒張效應(yīng) 按上述試驗(yàn)方法，在30 μmol/L苯腎上腺素預(yù)收縮的基礎(chǔ)上，分別加入0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 μmol/L的乙酰膽堿，結(jié)果如圖1所示，可見乙酰膽堿能很好地誘導(dǎo)小鼠腸系膜動(dòng)脈血管環(huán)的血管舒張效應(yīng)，該效應(yīng)隨濃度的增加而增大，并且在加入乙酰膽堿濃度為0.03～0.3 mol/L時(shí)舒張變化幅度最大。

圖1 乙酰膽堿對(duì)小鼠腸系膜動(dòng)脈舒張作用成濃度依賴性變化

2.2 檢測花生四烯酸對(duì)血管環(huán)非NO依賴性的舒張效應(yīng) 分別加入3、10 mol/L花生四烯酸檢測小鼠腸系膜動(dòng)脈血管環(huán)的舒張程度。結(jié)果如圖2所示：加入3 mol/L花生四烯酸誘導(dǎo)小鼠腸系膜動(dòng)脈血管環(huán)產(chǎn)生舒張效應(yīng)，約為23%；而加入10 mol/L花生四烯酸所誘導(dǎo)的舒張效應(yīng)約為64%。兩種濃度的花生四烯酸對(duì)小鼠腸系膜動(dòng)脈的舒張作用比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理（結(jié)果為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)完成）。

圖2 不同濃度花生四烯酸對(duì)小鼠腸系膜動(dòng)脈的舒張作用

3 討論

一般認(rèn)為，血管及其內(nèi)皮釋放的各種生化物質(zhì)在血管的舒縮功能中扮演著重要的角色，參與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。因此，建立一種能較好地檢測小管徑阻力血管功能的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)進(jìn)一步研究具有重要意義。

目前國內(nèi)在離體張力實(shí)驗(yàn)研究中，血管環(huán)多數(shù)采用管徑較大的血管（如大鼠主動(dòng)脈或小鼠主動(dòng)脈等），血管環(huán)橫切長度多為3.0～4.0 mm。而對(duì)更加短小的小鼠阻力血管（如腸系膜動(dòng)脈等）鮮見報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者采用的直徑較小的鎢絲（50 μm）和更加靈敏的微力傳感器（AE801），可檢測到直徑為100～200 μm、橫切長度為1.0 mm血管環(huán)，保證了細(xì)小血管內(nèi)皮的完整、并克服了其長度不夠的不足，從而充分滿足以腸系膜動(dòng)脈為代表的小鼠阻力血管舒縮反應(yīng)檢測的需要。在實(shí)驗(yàn)過程亦發(fā)現(xiàn)，血管剝離程度及速度直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)快速剝離干凈血管，以避免血管內(nèi)皮活性分子的活性減弱或喪失。

為了清晰地闡明小鼠腸系膜動(dòng)脈功能性參與，在不抑制NOS的情況下，直接加入血管內(nèi)皮受體激動(dòng)劑ACh后，結(jié)果引起血管環(huán)舒張效應(yīng)，并且該效應(yīng)隨ACh濃度增加而增大，導(dǎo)致該舒張效應(yīng)可能是通過血管內(nèi)皮依賴性NO、內(nèi)皮超極化因子（EDHF）和內(nèi)皮環(huán)氧化酶（COX）產(chǎn)物PGI2共同作用的結(jié)果，但起主要作用可能是內(nèi)皮依賴性NO的釋放，同時(shí)該實(shí)驗(yàn)也提示血管環(huán)的內(nèi)皮及平滑肌在操作過程中保持著完好的生理活性。雖然NO通過血管內(nèi)皮發(fā)揮舒張血管作用，但是非NO依賴性物質(zhì)亦在血管中亦發(fā)揮著重要作用。為此，通過L-NAME作用排除NO對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響的情況下，加入AA后，血管環(huán)產(chǎn)生非NO依賴性舒張效應(yīng)，提示AA可能通過其代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)產(chǎn)生舒張效應(yīng)。

綜上所述，通過兩種不同類型的刺激物都誘導(dǎo)小鼠腸系膜動(dòng)脈血管環(huán)的舒張效應(yīng)，表明該實(shí)驗(yàn)方法檢測以腸系膜動(dòng)脈為代表的小鼠阻力血管的舒縮反應(yīng)是完全可行的，從而為以小鼠為模型的心血管疾病研究中檢測阻力血管舒縮反應(yīng)提供直觀、可靠的實(shí)驗(yàn)方法。

[1]金鑫，姜薇，鄧琳瑕.心血管疾病危險(xiǎn)因素的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥指南，2012，10（31）：434-435.

[2]王燕鋒，彭曉暉，張晨瑤，等.原花色素對(duì)大鼠阻力血管舒張作用機(jī)制研究[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2010，15（2）：170-174.

[3]Zhou Y，Varadharaj S，Zhao X，et al.Acetylcholine causes endothelium-dependent contraction of mouse arteries[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289（3）：1027-1032.

[4]張映橋，余濤，許激揚(yáng)，等.天麻素對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用及其機(jī)制[J].中國中藥雜志，2012，37（14）：2135-2138.

[5]屈晨，唐亮，祝巖.菲諾貝特對(duì)高血壓大鼠血管內(nèi)皮收縮因子分泌的影響及其作用機(jī)制[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，34（3）：239-243.