孫曉雷 趙 斌, 馬信龍,△ 李秀蘭 馬劍雄 李 爽 楊 強(qiáng)

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是關(guān)節(jié)疾病中最常見的類型之一，其病理過(guò)程以軟骨細(xì)胞的凋亡和軟骨基質(zhì)的破壞為特征[1]。軟骨組織是覆蓋在關(guān)節(jié)面上的無(wú)血管特殊結(jié)締組織，時(shí)刻受到內(nèi)源性和外源性的力學(xué)刺激[2]，一定范圍的力學(xué)刺激對(duì)維持關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)功能的完整性起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞加載不同類型的力學(xué)刺激，會(huì)產(chǎn)生不同程度的細(xì)胞生物學(xué)變化[3-4]。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)體外培養(yǎng)的人OA軟骨細(xì)胞施加不同大小的循環(huán)牽張應(yīng)力，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，旨在研究循環(huán)牽張應(yīng)力與人OA軟骨細(xì)胞力學(xué)應(yīng)答的關(guān)系，并為OA的預(yù)防與治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，美國(guó)），EDTA、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma，美國(guó)），多克隆兔抗人Ⅱ型膠原一抗、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（博士德，武漢），甲苯胺藍(lán)、番紅O染液（東勝泰博，北京）；ElectroForce 3200力學(xué)實(shí)驗(yàn)儀、BioDynamic生物反應(yīng)倉(cāng)系統(tǒng)（Bose，美國(guó)），倒置相差顯微鏡（Olympus，日本），恒溫?fù)u床（Heidolph，德國(guó)），流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)），CO2培養(yǎng)箱（Hera-cell，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本取材 軟骨組織取自1例66歲女性左膝骨關(guān)節(jié)炎患者，在患者知情同意的情況下于手術(shù)治療時(shí)取少量軟骨組織，取材時(shí)嚴(yán)格無(wú)菌操作，取材組織部分行病理切片HE染色，參考Collins病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所取組織退變程度進(jìn)行分級(jí)。其余組織均在取材后2 h內(nèi)進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.2.2 軟骨細(xì)胞體外分離和培養(yǎng) 將所取組織用含抗生素的D-Hank’s液浸泡5 min，再用D-Hank’s液沖洗2遍，去除軟骨組織上沾染的血液和脂肪組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，加入含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶的消化液，37℃搖床消化30 min；棄去消化液，加入含0.25%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型膠原酶的消化酶搖勻，4℃冰箱過(guò)夜消化后，再置于搖床37℃消化2 h，至組織塊基本完全消化。加1 mL FBS終止消化，200目鋼網(wǎng)過(guò)濾，將濾液移至離心管，1 500 r/min離心7 min，棄上清，用含10%FBS的H-DMEM培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以密度為5×104個(gè)/mL接種于底面積為25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。24 h后半量換液，之后2 d換液1次，待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)消化傳代。

1.2.3 軟骨細(xì)胞的鑒定 （1）形態(tài)學(xué)觀察：倒置相差顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)。（2）甲苯胺藍(lán)染色：第一代細(xì)胞爬片至70%～80%融合時(shí)，將細(xì)胞爬片取出，用新配的4%多聚甲醛固定30 min，1%甲苯胺藍(lán)染色10 min，PBS清洗，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察細(xì)胞分泌糖胺聚糖的能力。（3）番紅O染色：第一代細(xì)胞爬片至70%～80%融合時(shí)，將細(xì)胞爬片取出，用新配的4%多聚甲醛固定30 min，1%番紅O染色10 min，PBS清洗，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察細(xì)胞分泌蛋白多糖的能力。（4）Ⅱ型膠原免疫熒光染色：第一代細(xì)胞爬片至70%～80%融合時(shí)，將細(xì)胞爬片取出，用新配的4%多聚甲醛固定30 min，將爬片固定于載玻片上，0.1%Triton X-100打孔30 min，PBS沖洗；3%H2O215 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，PBS沖洗；羊血清封閉液15 min，晾干；滴加1∶100稀釋兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體，濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜，PBS沖洗；滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，避光孵育2 h，PBS沖洗，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 循環(huán)牽張應(yīng)力加載 力學(xué)加載采用美國(guó)Bose公司BioDynamic細(xì)胞力學(xué)加載系統(tǒng)，見圖1，該系統(tǒng)以硅橡膠膜為細(xì)胞力學(xué)加載載體，配合ElectroForce3200動(dòng)力加載，整個(gè)系統(tǒng)由Bose PCI和Win Testing系統(tǒng)聯(lián)合控制持續(xù)時(shí)間、拉伸長(zhǎng)度、拉伸頻率等力學(xué)參數(shù)，使硅橡膠膜產(chǎn)生精確變形，使培養(yǎng)在其上面的細(xì)胞同時(shí)受到拉伸作用。細(xì)胞所受力的大小以硅橡膠膜拉伸應(yīng)變率（%）表示，應(yīng)變率越大，表示細(xì)胞所受牽張應(yīng)力越大。取P3代軟骨細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為3×105/mL，將700 μL細(xì)胞懸液滴加到4 cm×2 cm大小的硅橡膠膜上，培養(yǎng)24 h后，將其置于BioDynamic生物反應(yīng)倉(cāng)內(nèi)進(jìn)行力學(xué)加載?；陬A(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)[5]報(bào)道，實(shí)驗(yàn)分為以下4組：空白對(duì)照組（0應(yīng)變組）、5%拉伸應(yīng)變組、10%拉伸應(yīng)變組、15%拉伸應(yīng)變組，每組3個(gè)樣本。加載頻率為0.25 Hz，加載時(shí)間為3 h。培養(yǎng)液儲(chǔ)存罐置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中，由管道與反應(yīng)倉(cāng)相連。蠕動(dòng)泵以15 mL/min的速度使培養(yǎng)基在整個(gè)系統(tǒng)中循環(huán)，以此來(lái)保證加載過(guò)程中反應(yīng)倉(cāng)內(nèi)的溫度及CO2濃度。

1.2.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期 細(xì)胞加載結(jié)束后，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，給予細(xì)胞充分反應(yīng)時(shí)間。酶消化法消化各組細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，去上清，用無(wú)菌D-Hank’s液輕微漂洗2次，75%冷乙醇固定；細(xì)胞2 000 r/min離心5 min，去上清，加入500 μL RNA酶，37 ℃孵育30 min；2 000 r/min離心5 min，去上清，加500 μL碘化丙啶，室溫避光孵育30 min，300目篩過(guò)濾，上機(jī)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA含量和細(xì)胞周期，采用Flow Plus軟件處理數(shù)據(jù)。根據(jù)細(xì)胞周期中G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例來(lái)計(jì)算S期細(xì)胞比例（%）及細(xì)胞增殖指數(shù)（proliferative index，PI）。公式為：S期（%）=1-[G0/G1期(%)+G2/M期(%)]，PI（%）=S期（%）+G2/M期（%）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨組織大體觀及病理表現(xiàn) 大體觀：關(guān)節(jié)軟骨失去原有光澤，顏色明顯變暗，股骨外側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨表面有缺損，軟骨下骨外露，見圖2A。鏡下可見軟骨縱行裂隙形成，呈纖絨樣變，細(xì)胞排列紊亂，在軟骨深層見細(xì)胞聚集現(xiàn)象，見圖2B。結(jié)合患者臨床及病理資料，關(guān)節(jié)軟骨為中、重度退變。

2.2 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡下示：剛接種的原代軟骨細(xì)胞呈圓形或橢圓形，12～16 h開始貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞核呈圓形，胞質(zhì)豐富；24 h后貼壁細(xì)胞開始伸展、增殖，呈三角形、長(zhǎng)梭形或多角形；7 d后增長(zhǎng)至爬滿瓶底，胞體豐富，胞漿均勻，核大而圓。傳代后軟骨細(xì)胞形態(tài)良好，呈克隆樣生長(zhǎng)，細(xì)胞間互相連接呈“鋪路石樣”狀態(tài)。見圖3。

2.3 軟骨細(xì)胞鑒定 甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色，說(shuō)明細(xì)胞可分泌糖胺多糖；番紅O染色結(jié)果顯示細(xì)胞質(zhì)被染成紅色，說(shuō)明細(xì)胞可分泌蛋白多糖；Ⅱ型膠原免疫熒光染色顯示胞質(zhì)呈綠色熒光，說(shuō)明細(xì)胞能夠分泌合成Ⅱ型膠原，見圖4。以上結(jié)果均提示培養(yǎng)細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。

2.4 不同循環(huán)牽張應(yīng)力對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖的影響 在選定的0、5%、10%及15%4個(gè)應(yīng)變點(diǎn)，隨著刺激的增大，S期細(xì)胞百分比先逐漸增加而后減弱，在10%應(yīng)變組軟骨細(xì)胞增殖最佳，5%、10%、15%應(yīng)變組均高于0應(yīng)變組（Plt;0.05），10%應(yīng)變組高于5%應(yīng)變組（Plt;0.05），但5%、10%應(yīng)變組與15%應(yīng)變組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。PI亦隨著刺激的增大先逐漸增強(qiáng)而后減弱，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。

Table 1 Effects of cyclic stretch strain on the proliferation of human degenerative articular chondrocytes表1 不同循環(huán)牽張應(yīng)力對(duì)人退變軟骨細(xì)胞增殖的影響（n=6，%，x±s）

3 討論

3.1 關(guān)節(jié)軟骨退變及其修復(fù) OA是關(guān)節(jié)疾病中最常見的類型之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，中老年人群中60%有明顯OA的影像學(xué)改變[6]。疾病主要累及負(fù)重的大關(guān)節(jié)，其病理過(guò)程以關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解破壞為特征，而生理學(xué)認(rèn)為成熟的軟骨組織無(wú)血液支配，組織損傷后無(wú)凝血及炎癥因子的釋放，亦無(wú)血液中未分化細(xì)胞向損傷部位的遷移，并且軟骨細(xì)胞為終末細(xì)胞，其增殖和遷移能力極差，因此軟骨損傷與退變后的修復(fù)能力很差。另外，軟骨組織沒有神經(jīng)支配，理論上軟骨細(xì)胞通過(guò)血液和神經(jīng)的信息傳導(dǎo)系統(tǒng)接受環(huán)境變化的信號(hào)極其有限。Wu等[7-8]研究證實(shí)軟骨細(xì)胞對(duì)應(yīng)變的感應(yīng)非常敏感，能使細(xì)胞獲得環(huán)境變化的足夠信息。

軟骨退變是OA共有的基礎(chǔ)病理過(guò)程，基于軟骨組織本身特點(diǎn)，認(rèn)為軟骨退變是一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的過(guò)程。但臨床發(fā)現(xiàn)OA患者骨贅表面軟骨可分泌Ⅱ型膠原，即證實(shí)其軟骨為透明軟骨，且作為對(duì)關(guān)節(jié)退變的代償反應(yīng)，其透明軟骨是由關(guān)節(jié)軟骨增殖遷移到周邊骨質(zhì)的。另有部分OA患者隨著病程發(fā)展到一定階段，其臨床癥狀逐漸減輕甚至消失，部分退變軟骨面得到修復(fù)并穩(wěn)定下來(lái)；并且進(jìn)行截骨術(shù)矯正關(guān)節(jié)負(fù)重力線后，退變軟骨出現(xiàn)修復(fù)現(xiàn)象。以上現(xiàn)象均提示退變的軟骨具有恢復(fù)正常生理功能的潛能。

3.2 關(guān)節(jié)軟骨與細(xì)胞力學(xué) 關(guān)節(jié)軟骨在體內(nèi)處于復(fù)雜的生理力學(xué)環(huán)境[9]。這些機(jī)械刺激是維持關(guān)節(jié)軟骨正常結(jié)構(gòu)和功能的重要因素。岳海濤等[10-11]研究表明周期性機(jī)械應(yīng)力有利于模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，能顯著促進(jìn)組織工程軟骨的質(zhì)量。Xu等[12]對(duì)大鼠終板軟骨細(xì)胞加載間歇循環(huán)機(jī)械張力（0.5 Hz，10%形變，4 h/d，5 d/周），結(jié)果發(fā)現(xiàn)張力刺激可促進(jìn)終板軟骨細(xì)胞增殖。Thomopoulos等[5]對(duì)三維體外培養(yǎng)模型中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）加載循環(huán)拉伸張力（1 Hz，10%形變，共培養(yǎng)7 d），結(jié)果顯示循環(huán)拉伸張力可促進(jìn)紡錘狀細(xì)胞形成，上調(diào)Ⅰ型膠原和糖胺多糖（GAG）合成。由此筆者認(rèn)為，適當(dāng)?shù)膹埩纱龠M(jìn)軟骨細(xì)胞增殖及基質(zhì)合成代謝，維持軟骨細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，而超出軟骨細(xì)胞承載范圍的張力則可能抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能和完整性受到破壞，進(jìn)而損傷關(guān)節(jié)軟骨。損傷的軟骨組織承受力學(xué)刺激的能力減弱，可能進(jìn)一步加重力學(xué)刺激，形成惡性循環(huán)，直至軟骨組織結(jié)構(gòu)及功能完全喪失。

本實(shí)驗(yàn)所用退變關(guān)節(jié)軟骨為1例66歲老年女性O(shè)A患者手術(shù)標(biāo)本，通過(guò)病理學(xué)方法評(píng)價(jià)其退變程度。體外分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞施加不同大小循環(huán)牽張應(yīng)力刺激，觀察應(yīng)力刺激性細(xì)胞的增殖情況。此方法排除了炎性因子以及其他混雜因素的干擾，從細(xì)胞水平研究了單純循環(huán)牽張應(yīng)力刺激對(duì)軟骨細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示與0應(yīng)變組相比，各應(yīng)變組S期細(xì)胞百分比與PI均增加，以10%應(yīng)變組最為明顯，由此認(rèn)為應(yīng)力對(duì)軟骨細(xì)胞增殖有一定影響，并且10%～15%的應(yīng)變區(qū)間可能是人OA軟骨細(xì)胞增殖最佳的應(yīng)力范圍。

Figure 1 The EF3200 mechanical loading system equipped with BioDynamic bioreactor圖1 ElectroForce3200力學(xué)加載系統(tǒng)搭載BioDynamic生物反應(yīng)倉(cāng)

Figure 2 The degenerated human articular cartilage usedin the experiment圖2 實(shí)驗(yàn)所取退變關(guān)節(jié)軟骨組織

Figure 3 The degenerated articular chondrocytes圖3 退變軟骨細(xì)胞

Figure 4 The identification of degenerated articular chondrocytes圖4 軟骨細(xì)胞鑒定

[1]劉興漠,項(xiàng)禹誠(chéng),孫青,等.周期性張應(yīng)力對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞p38MAPK表達(dá)及其磷酸化的影響[J].中國(guó)病理生理雜志,2012,28(2):362-365.

[2]Xu HG,Hu CJ,Wang H,et al.Effects of mechanical strain on ANK,ENPP1 and TGF-β1 expression in rat endplate chondrocytes in vi?tro[J].Mol Med Rep,2011,4(5):831-835.

[3]Moukoko D,Pourquier D,Pithioux M,et al.Influence of cyclic bend?ing loading on in vivo skeletal tissue regeneration from periosteal or?igin[J].Orthop Traumatol Surg Res,2010,96(8):833-839.

[4]Freemont AJ.The cellular pathobiology of the degenerate interverte?bral disc and discogenic back pain[J].Rheumatology(Oxford),2009,48(1):5-10.

[5]Thomopoulos S,Das R,Birman V,et al.Fibrocartilage tissue engi?neering:the role of the stress environment on cell morphology and matrix expression[J].Tissue Eng Part A,2011,17(7-8):1039-1053.

[6]商鵬,陳維毅,衛(wèi)小春,等.周期性張應(yīng)變力對(duì)幼年和成年及骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞產(chǎn)生糖胺多糖的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2010,4(16):1-3.

[7]Wu JZ,Herzog W.Analysis of the mechanical behavior of chondro?cytes in unconfined compression tests for cyclic loading[J].J Bio?mech,2006,39(4):603-616.

[8]Akisaka T,Yoshida H,Inoue S,et al.Organization of cytoskeletal F-actin,G-actin,and gelsolin in the adhesion structures in cultured osteoclast[J].J Bone Miner Res,2001,16(7):1248-1255.

[9]Hirano Y,Ishiguro N,Sokabe M,et al.Effects of tensile and com?pressive strains on response of a chondrocytic cell line embedded in typeⅠcollagen gel[J].J Biotechnol,2008,133(2):245-252.

[10]岳海濤,范衛(wèi)民,馬益民,等.不同強(qiáng)度周期性壓力對(duì)組織工程軟骨的影響[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2007,9(7):661-664.

[11]張廣程,范衛(wèi)民,馬益民,等.不同頻率周期性壓力對(duì)組織工程軟骨的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2007,24(6)：677-678.

[12]Xu HG,Zhang XH,Wang H,et al.Intermittent Cyclic Mechanical Tension Induced Calcification and downregulation of ankh gene ex?pression of end plate chondrocyte[J].Spine(Phila Pa 1976),2012,37(14):1192-1197.