楊艷麗 胡建國 司 岑△

胃癌是一種高死亡率的世界性惡性腫瘤[1]，其病因與致病機制研究一直為國內(nèi)外學(xué)者所重視，但至今尚未明了,可能是一個多因素、多基因異常參與的過程。幽門螺旋桿菌（Hp）感染與慢性胃炎、消化性潰瘍、癌前病變及胃癌的關(guān)系已被公認(rèn)。Epstein-Barr virus（EBV）是一種DNA皰疹病毒，潛伏體內(nèi)可引起人B淋巴細(xì)胞系發(fā)生“永生化”，它與鼻咽癌、傳染性單核細(xì)胞增多癥、Burkitt淋巴瘤等多種疾病有關(guān)，近年研究發(fā)現(xiàn)EBV亦可侵犯上皮組織，在部分胃癌組織檢測到有EBV感染，其與胃癌發(fā)生的關(guān)系及機制研究已逐漸成為熱點[2]。本研究旨在探討EBV、Hp感染與胃癌的關(guān)系及二者在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中是否存在相互作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年9月—2012年9月于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院行手術(shù)切除、病理確診的胃癌患者（胃癌組）100例，其中男66例，女34 例，年齡33～84歲，平均（58.67±10.33）歲，取其手術(shù)組織石蠟包埋，連續(xù)病理切片取材，厚度4～6 μm。另擇同期行胃鏡檢查、病理確診的胃炎患者（胃炎組）82例，其中男、女各41例，年齡19～80歲，平均（47.56±12.93）歲，取其內(nèi)鏡活檢組織2～3塊，-80℃儲存?zhèn)溆?。所有患者一般資料詳實，無其他腫瘤或惡性合并癥，無放化療史，無抗Hp藥物服用史。

1.2 主要儀器與試劑 組織基因組DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.TMFFPE DNA Kit,美國），ISH-5022 EBER 原位雜交（ISH）試劑盒[包括胃酶、胃酶稀釋液、地高辛標(biāo)記的EBER探針、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗地高辛抗體、DAB稀釋液和濃縮液、PBS 緩沖液]，Taq MasterMix（包括 Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs及PCR穩(wěn)定劑和增強劑），RNA-free H2O，瓊脂糖，TBE緩沖液，無水乙醇、二甲苯、溴化乙錠；病理組織切片機，恒溫水浴箱，核酸蛋白測定儀，eppendorf PCR儀，恒溫生化培養(yǎng)箱，BiO-RAD水平核酸電泳系統(tǒng)、Gel Doc XR凝膠成像儀等。

1.3 組織DNA提取質(zhì)量檢測 嚴(yán)格按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取組織DNA,并經(jīng)核酸蛋白測定儀檢測,平均濃度約為152.8 mg/L，OD260/OD280比值均在1.8～2.1之間，DNA質(zhì)量均合格。

1.4 引物的設(shè)計合成 分別參照文獻(xiàn)[3-4]設(shè)計擴增EBV基因組的特異性引物EBNA1和擴增Hp基因組的特異性引物Hp 16 S rRNA，由上海生工生物公司合成，見表1。

Table 1 The PCR primer sequences and the length of gene products表1 PCR引物序列及預(yù)計產(chǎn)物片段長度

1.5 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測EBV、Hp感染 PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,上下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，RNA-free H2O8.5 μL。EBV反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min、94℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min（擴增30個循環(huán)）；最后72℃總延伸5 min。Hp反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s（擴增30個循環(huán)）；72℃總延伸5 min。取PCR擴增產(chǎn)物6.0 μL經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠110 V電壓電泳30 min，溴化乙錠染色20 min，紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果并記錄。

1.6 ISH技術(shù)檢測EBV編碼小RNA（EBER） （1）標(biāo)本的收集和預(yù)處理：選取經(jīng)PCR檢測EBV DNA表達(dá)陽性的石蠟包埋組織，顯微切割成4 μm的切片，60℃烤片過夜后用新鮮二甲苯脫蠟，然后在新鮮100%乙醇中放置數(shù)分鐘后空氣干燥。（2）酶處理：組織切片加入適量新鮮配制的胃酶工作液37℃孵育30 min，棄去胃酶工作液，逐級乙醇脫水（70%、95%和100%）各1 min，空氣干燥。（3）雜交程序：組織切片上加10 μL地高辛標(biāo)記的EBER RNA探針,加蓋蓋玻片于濕盒中37℃雜交過夜，后用PBS緩沖液沖洗切片數(shù)次并使蓋玻片自然脫落。（4）檢測和顯色程序：切片上加入適量HRP酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，37℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗1 min×3次；加入適量DAB工作液，顯色10 min，光鏡下觀察顯色情況；后用蒸餾水沖洗切片。（5）復(fù)染：選擇蘇木素復(fù)染10 s，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片。（6）結(jié)果判定:顯微鏡下觀察見細(xì)胞核著棕褐色者為陽性，證實為EBV感染;無細(xì)胞核著色者為陰性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，2組指標(biāo)比較采用χ2檢驗或校正χ2檢驗，胃癌組織中EBV與Hp感染的相關(guān)性分析采用行×列表資料的關(guān)聯(lián)性分析，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組EBV、Hp的感染 胃癌組有9例（9.0%）呈EBV感染陽性，且?guī)缀跛邪┘?xì)胞可見濃染呈棕褐色的EBER表達(dá)陽性細(xì)胞核，胃炎組均未檢測到EBV基因，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.967,P＜0.05）。胃癌組、胃炎組分別有56例（56.0%）、33例（40.2%）呈Hp感染陽性，胃癌組高于胃炎組（χ2=4.476,P＜0.05），見圖1～3。

Figure 1 PCR analysis of EBV DNA圖1 PCR檢測EBV DNA

1、5：Hp DNA陰性；2、3、4：Hp DNA陽性Figure 2 PCR analysis of Hp DNA圖2PCR檢測Hp DNA

2.2 EBV、Hp感染與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 賁門胃體癌較胃竇癌、低分化癌較中高分化癌EBV感染率高（P＜0.05），不同性別、年齡、民族以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間EBV感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。低分化癌較中高分化癌Hp感染率高（P＜0.05），不同性別、年齡、民族、發(fā)生部位及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間Hp感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

Figure 3 In situ hybridization detection of EBV RNA in gastric cancer(×200)圖3 ISH檢測胃癌組織中EBV RNA表達(dá)（×200）

Table2 Correlation between EBV,Hp infection and clinical and pathological features in patients with gastric cancer表2 EBV、Hp感染與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃癌組EBV、Hp感染的相關(guān)性 9例EBV感染陽性者中有7例（77.8%）Hp感染陽性，而91例EBV陰性者中有49例（53.8%）Hp亦呈陽性，胃癌組EBV與Hp感染間無相關(guān)性（r=0.137，P＞0.05）。

3 討論

3.1 EBV感染與胃癌 EBV屬人類皰疹病毒科γ亞科成員，最早從人Burkitt’s淋巴瘤組織中分離獲得，已證實它與多種上皮細(xì)胞疾病有關(guān)。自1990年Burke等[5]首次報道EBV與胃癌相關(guān)以來，EBV相關(guān)胃癌（EBV associated gastric cancer，EBVaGC）逐漸受到人們重視。目前檢測腫瘤細(xì)胞中EBV的主要方法是PCR和ISH技術(shù)，前者簡單、經(jīng)濟(jì)，但假陽性率高，后者為確診EBV感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但價格昂貴，綜合考慮，本研究采用2種技術(shù)協(xié)同的方法。結(jié)果顯示82例胃炎組織中均無EBV陽性表達(dá)，而100例胃癌組織中有9例呈EBV感染陽性，且?guī)缀跛邪┘?xì)胞胞核中均可見呈棕褐色的EBER顆粒，同郭云娣等[6]研究結(jié)果一致，提示EBV感染是胃癌發(fā)生的早期危險因素，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，筆者推測其作用機制是：受EBV感染的上皮細(xì)胞在病毒基因組的指導(dǎo)下產(chǎn)生各種EBV相關(guān)抗原（如EBNA1、LMP2A、BARF1等），進(jìn)而使胃上皮細(xì)胞的癌基因活化和抑癌基因突變或失活,促進(jìn)胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致胃癌[7-8]，一些抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的異常甲基化被認(rèn)為是EBVaGC最早出現(xiàn)且最主要的分子異常表現(xiàn)[9-10]，但具體作用機制仍待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)EBVaGC以賁門、胃體多見，且以低分化癌為主，提示此類患者惡性度較高，對胃中上部疾患（如潰瘍、癌前病變等），可考慮開展EBV篩查項目，對檢查結(jié)果陽性者定期胃鏡隨訪觀察，謹(jǐn)防癌變。

3.2 Hp感染與胃癌 Hp是1983年前澳大利亞學(xué)者M(jìn)arshall和Warren首次分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)的，已被證實Hp感染可導(dǎo)致慢性胃炎、消化性潰瘍等疾病的發(fā)生，并可增加潰瘍出血的風(fēng)險，且與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切[11]。本研究也表明胃癌組Hp陽性感染率高于胃炎組，提示Hp是促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的另一重要因素，考慮可能與Hp產(chǎn)生的大量毒性物質(zhì)如尿素酶、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白（cagA）、細(xì)胞空泡毒素A（vacA）等有關(guān)，它們不僅可削弱胃黏膜及黏液層的屏障保護(hù)作用，還可引起各種不良反應(yīng)。近期研究發(fā)現(xiàn)Hp破壞宿主細(xì)胞質(zhì)膜,使局部的細(xì)胞外Ca2+逆流，Ca2+可促進(jìn)膜聯(lián)蛋白家族成員A1和A4及細(xì)胞表面修復(fù)因子LMAP-2的表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)宿主細(xì)胞增殖[12]；國內(nèi)也有研究證實Hp感染可以誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞染色體DNA雙鏈斷裂，進(jìn)而刺激一系列染色體的修復(fù)，基因重組過程中增加了染色體錯配的概率，進(jìn)而導(dǎo)致癌變的發(fā)生[13]。本研究結(jié)果表明低分化癌組織Hp陽性感染率顯著高于中、高分化癌組織，與相關(guān)研究結(jié)果一致[14-15]，提示Hp感染可能參與胃癌的惡性進(jìn)展過程。

3.3 胃癌組織中EBV、Hp感染的相關(guān)性 目前關(guān)于EBV與Hp在胃癌發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)性研究報道較少。有極少研究認(rèn)為EBV和Hp cagA在胃癌的發(fā)生發(fā)展中具有協(xié)同作用，推測可能是Hp cagA菌定植于胃黏膜上皮細(xì)胞誘發(fā)炎性變，增加了EBV的易感性所致[16]。本研究結(jié)果顯示胃癌組織中EBV與Hp感染陽性率間無相關(guān)性，提示EBV和Hp感染可能是致胃癌發(fā)生的2個獨立危險因素，同Wang等[15]研究結(jié)果一致。

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