李忠亮，張治然，襲榮剛（解放軍第210醫(yī)院藥學部，遼寧大連 116021）

苯扎貝特（Bezafibrate）是氯貝丁酸衍生物類血脂調節(jié)藥，能夠降低升高了的血清甘油三酯、總膽固醇以及極低密度脂蛋白-膽固醇的水平，從而使高脂血癥患者的脂質正?；?。其作用機制有2個方面：（1）抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶而減少膽固醇的合成；（2）增加脂蛋白酯酶和肝酯酶的活性而加快甘油三酯的清除以及增加高密度脂蛋白-膽固醇的水平。本藥還可以輕度降低血糖，適用于糖尿病伴高脂血癥患者。國內關于苯扎貝特在健康人體內的藥動學研究數(shù)據(jù)并不充分，本試驗開展苯扎貝特在不同性別健康人體內的藥動學研究，從而為臨床合理應用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-10 ATvp高壓液相色譜儀，包括Sil-10 ADvp自動進樣器、SPD-10 Avp紫外檢測器、Class-VP色譜工作站（日本島津公司）；TGL-16 M臺式高速冷凍離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司）；XW-80 A微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；TG328 A型分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；Delta 320型精密pH計（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；MTN-2800 W氮吹濃縮裝置（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

苯扎貝特片（阿貝他，江蘇天力士貝特制藥有限公司，規(guī)格：每片200mg，批號：06050103）；苯扎貝特對照品（批號：100627-200801，純度：98.0%，0.98 mg/1 mg）、格列吡嗪（內標，批號：100285-200604，純度：99.9%，0.999mg/1mg）均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，冰乙酸、正己烷、無水乙醚、無水乙酸鈉、四丁基溴化銨均為分析純；水為二次蒸餾水；空白人血漿由解放軍第210醫(yī)院輸血科提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.01 mol/L乙酸鈉緩沖液（用冰乙酸調pH為4.0）-0.5 mol/L四丁基溴化銨（65∶35∶0.2，V/V/V）；流速：1.2 ml/min；紫外檢測波長：232 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μl。在此色譜條件下，藥物、血漿中內源性雜質和內標分離完全，峰形良好，其色譜圖見圖1。內標格列吡嗪的保留時間約為7.2 min，苯扎貝特的保留時間約為10.5 min，分離度＞1.5。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 受試者選擇

選擇健康志愿者20名，其中男、女各10名，年齡為（26.4±1.3）歲，體質量為（55.8±5.5）kg，身高為（168.3±2.6）cm。體格檢查示肝、腎功能無異常，不吸煙、不嗜酒。女性健康志愿者受試時間避開月經(jīng)、妊娠及哺乳期。試驗前2周內未服用任何其他藥物。受試者均簽署知情同意書。臨床試驗方案經(jīng)解放軍第210醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

2.3 試驗方案

試驗采用單劑量給藥。受試者于試驗前1日晚餐后，開始禁食不禁水；于試驗日晨空腹口服給藥400 mg，以溫開水200 ml吞服，服藥2h后，可自由飲水；4h后，進統(tǒng)一清淡低脂飲食。服藥期間禁煙、酒和含咖啡因類飲料，避免劇烈運動和長時間臥床。

2.4 血樣采集

受試者于服藥前（0h）和服藥后的0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h時于肘靜脈取血5 ml，置肝素化試管中，3.5×103r/min離心（離心半徑為15 cm）10 min，分離血漿，置－70℃冰箱保存待測。

2.5 樣品預處理

精密量取血漿200 μl，置10 ml離心管中，加入甲酸 40 μl，加入內標溶液（25 μg/ml格列吡嗪）40 μl，加入1 mol/L鹽酸 50 μl，渦旋1 min，加入乙醚-正己烷（2∶1）提取液2 ml，振蕩混合2 min，4×103r/min離心（離心半徑為15 cm）10 min，取有機層，置5ml離心管中，于37℃水浴中氮氣流吹干，殘渣用流動相300 μl溶解，渦旋1 min，移至1.5 ml離心管中，1.5×104r/min離心（離心半徑為15 cm）5 min，取上清液20 μl進樣分析。

2.6 標準溶液的配制

準確稱取苯扎貝特對照品102.4 mg，置1000 ml量瓶中，用甲醇溶解定容，制成100.0 μg/ml苯扎貝特貯備液。精密量取0.5、1.5、5.0、12.5、25.0、50.0、100.0ml置100ml量瓶中，用甲醇定容，即得0.5、1.5、5.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/ml系列質量濃度標準溶液。另準確稱取格列吡嗪對照品25.0 mg，置1000 ml量瓶中，用甲醇溶解定容，制成25 μg/ml格列吡嗪內標溶液。

2.7 標準曲線的制備

精密量取空白血漿200 μl，置10 ml離心管中，分別精密加入上述苯扎貝特系列標準溶液各40 μl，制成血漿中含苯扎貝特為0.1、0.3、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/ml的血漿樣品，按“2.5”項下方法處理血漿樣品，進行色譜分析，記錄色譜。以苯扎貝特的峰面積與內標峰面積比（R）對濃度（c）進行線性回歸，得血漿標準曲線方程：R＝0.27548 c－0.12549（r＝0.9993），結果表明，苯扎貝特血藥濃度在0.1～20.0 μg/ml范圍內線性關系良好。本法測定血漿中苯扎貝特的定量下限為0.1 μg/ml。

2.8 精密度及回收率試驗

按“2.7”項下方法配制苯扎貝特低、中、高（0.250、2.038、13.333 μg/ml）3個質量濃度的血漿樣品，按“2.5”項下方法處理后進行色譜分析，將所得的藥物峰面積與內標峰面積的比值代入標準曲線方程，計算方法回收率。將測定值與相應濃度對照品溶液直接進樣所得結果比較，計算提取回收率。取上述各濃度血樣于同一天內分別測定5次，連測5 d，計算日內和日間RSD。精密度及回收率試驗結果見表1。

表1 精密度及回收率試驗結果（n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery tests（n＝5）

2.9 穩(wěn)定性試驗

同“2.8”項下方法配制低、中、高3個質量濃度血漿樣品，每個濃度3份。1份按“2.5”項下方法操作，在室溫放置24 h，考察血漿樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性；1份于－70℃冰箱冷凍，反復凍融3次，按“2.5”項下操作，考察血漿樣品經(jīng)反復凍融的穩(wěn)定性；1份于－70℃冷凍保存1個月，按“2.5”項下操作，考察血漿樣品在長期冷凍條件下的穩(wěn)定性。結果顯示RSD均＜10%（n＝3），表明苯扎貝特在室溫、反復凍融以及長期冷凍條件下穩(wěn)定性均較好。

2.10 藥動學參數(shù)

20名健康志愿者單劑量口服苯扎貝特片400 mg后，苯扎貝特平均藥-時曲線見圖2。用DAS 2.1程序軟件進行處理，以赤池信息量準則（AIC）值作為模型識別指標，結果符合二室開放模型。

圖2 健康志愿者單劑量口服400mg苯扎貝特片后平均藥-時曲線（±s ，n＝10）Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of Bezafibrate tablets 400 mg in healthy volunteers after oral single dose（±s ，n＝10）

2.11 不同性別受試者藥動學參數(shù)的比較

不同性別健康志愿者單劑量口服苯扎貝特片400 mg的藥動學參數(shù)見表2。采用梯形法計算AUC0-12h值，tmax和cmax均為實測值。主要藥動學參數(shù)經(jīng)對數(shù)轉換后采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，比較不同性別受試者的藥動學參數(shù)，結果cmax、t1/2等差異均無顯著性（P＞0.05）。

表2 健康志愿者單劑量口服400mg苯扎貝特片后主要藥動學參數(shù)（±s， n＝20）Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of Bezafibrate tablets 400 mg in healthy volunteers after oral single dose（±s ，n＝20）

表2 健康志愿者單劑量口服400mg苯扎貝特片后主要藥動學參數(shù)（±s， n＝20）Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of Bezafibrate tablets 400 mg in healthy volunteers after oral single dose（±s ，n＝20）

藥動學參數(shù)t1/2，h cmax，μg/ml tmax，h Vd/F，L/k g CL/F，L/（h·k g）A U C0-12h，μg·h/ml A U C0-∞，μg·h/ml男性2.06±0.3311.41±3.241.93±0.290.25±0.067.73±0.4135.46±9.2640.34±10.35女性2.03±0.2711.06±3.062.07±0.380.23±0.047.52±0.2839.36±9.6339.57±9.28平均數(shù)值2.05±0.3111.24±3.152.02±0.360.24±0.057.68±0.3137.54±9.4539.46±9.82

2.12 安全性評價

20名健康受試者中，未發(fā)生明顯不良反應，說明受試者在試驗期間對單次口服苯扎貝特片耐受良好。

3 討論

參照文獻[1-3]，生物樣品的提取回收率一般較低，本試驗考查了苯扎貝特的多種提取方法，比如高氯酸等蛋白沉淀劑等，最終選擇乙醚-正己烷（2∶1）為提取液，較好地保證了苯扎貝特有較高的提取回收率。最終確立的色譜檢測條件和血漿提取方法操作簡便快速、準確性高、專一性強、成本低、檢測靈敏度理想、回收率高、最低定量下限為0.1 μg/ml，適合苯扎貝特的人體藥動學研究。

參照文獻[1，4]，苯扎貝特在堿性條件下非常容易發(fā)生降解，在氧化和酸性條件下也會發(fā)生降解。經(jīng)篩選，采用甲醇-0.01 mol/L乙酸鈉緩沖液（用冰乙酸調pH為4.0）-0.5 mol/L四丁基溴化銨（65∶35∶0.2，V/V/V）作為本次試驗的流動相，可以有效地抑制苯扎貝特解離，同時又保證苯扎貝特與內標和血漿內源物的分離度符合要求，減少色譜峰拖尾。

20名健康志愿者單劑量口服400 mg苯扎貝特片后，血藥濃度經(jīng)DAS程序軟件進行處理，以AIC值作為模型識別指標，結果符合二室開放模型；藥動學參數(shù)與國內外文獻報道基本相符，性別因素對本品藥動學無明顯影響（P＞0.05）。

[1]Castoldi D，Monzani V，Tonfanetti O.Determination of bezafibrate in human plasma and urine by high performance liquid chromatography[J].J Chromatogo Biomed Appl，1985，344（8）：259.

[2]肖峰，吳成義，陶春蕾，等.苯扎貝特膠囊的人體生物利用度和生物等效性研究[J].中國臨床藥理學與治療學，2008，13（3）：315.

[3]譚力，錢峰，張杰，等.國產苯扎貝特片人體相對生物利用度的研究[J].中國臨床藥理學雜志，2000，16（4）：292.

[4]黃春森，黃東.苯扎貝特樣品的穩(wěn)定性探討[J].中國醫(yī)療前沿，2008，3（21）：103.