朱雪萍，陳曉萌，秦玉花，趙寧民，馬愛玲，趙淑娟，蔡海霞（1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，鄭州45005；.鄭州大學(xué)河南省人民醫(yī)院，鄭州 45000）

拉莫三嗪是是一種新型的抗癲癇類藥，能穩(wěn)定突觸前膜，抑制谷氨酸和天冬氨酸的釋放。奧卡西平是國(guó)際公認(rèn)的較好的新型抗癲癇藥，是卡馬西平衍生物，在體內(nèi)迅速代謝為活性產(chǎn)物單羥奧卡西平和環(huán)氧卡馬西平，副作用較小，無不良藥物相互作用。這2種藥物個(gè)體差異較大，治療窗窄，受多種藥物相互作用的影響，且毒性反應(yīng)與血藥濃度密切相關(guān)。二者在臨床上常有聯(lián)用，均可借助血藥濃度監(jiān)測(cè)來調(diào)整劑量[1-2]，以達(dá)到提高療效、規(guī)避不良反應(yīng)的目的。本研究以氯唑沙宗為內(nèi)標(biāo)，用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定上述2種藥物的血藥濃度，操作簡(jiǎn)單、回收率高、精密度好，可以同時(shí)用于檢測(cè)拉莫三嗪和奧卡西平的血藥濃度。

1 材料

1.1 儀器

680高效液相色譜儀，包括ASI-100進(jìn)樣器、TCC-100柱溫箱、UVD170 U檢測(cè)器（美國(guó)戴安公司）；MM-3定時(shí)微量振蕩器、可調(diào)微量加樣槍（泰州科健醫(yī)療用品有限公司）；0412-1離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；PS3120超聲波清洗器（美國(guó)Sonics公司）；FA1104電子分析天平（上海天平儀器廠，稱量范圍：0～120 g，讀數(shù)精度：0.1 mg）；TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（上海恒勤儀器設(shè)備有限公司）；NH-866渦旋混和器（萊利達(dá)國(guó)際公司）。

1.2 藥品與試劑

拉莫三嗪對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100775-200401，純度：100%）；奧卡西平對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100657-200401，純度：100%）；內(nèi)標(biāo)：氯唑沙宗標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100364-200301，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：100%，mg/ml）；乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma公司C18柱（200mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05%三氟乙酸-水（40∶60∶0.0005，V/V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；流速：1 ml/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的配制

取拉莫三嗪4.4 mg、奧卡西平5.2 mg，準(zhǔn)確稱定，分別用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，使其質(zhì)量濃度分別為440 μg/ml和520 μg/ml。準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)氯唑沙宗標(biāo)準(zhǔn)品2.4 mg，加入甲醇溶解并定容至100 ml量瓶中，使其質(zhì)量濃度為24 μg/ml。

2.3 血漿樣品預(yù)處理

取血漿樣品100 μl于1.5 ml離心管中，加入甲醇溶液300 μl，渦旋混合 2min，超聲提取 10min，4000r/min 離心 15 min。定量吸取上清液，40℃空氣吹干，殘留物加流動(dòng)相100 μl溶解，渦旋混合1 min，12000 r/min離心15 min，取上清液20 μl進(jìn)樣，得含拉莫三嗪0.5～50 μg/ml、奧卡西平0.5～50 μg/ml的系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)血樣。

2.4 專屬性考察

在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，取空白血漿按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，結(jié)果表明血漿內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)樣品測(cè)定無干擾。取“2.3”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)血樣處理后進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果表明拉莫三嗪、奧卡西平與內(nèi)標(biāo)氯唑沙宗的保留時(shí)間分別為7.41、15.44、18.14 min，各成分峰形良好、分離完全。

2.5 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

取“2.3”項(xiàng)下含拉莫三嗪50、10、2、1、0.5 μg/ml和奧卡西平50、10、2、1、0.5 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)血樣，處理后進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。分別以樣品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比（Y）對(duì)濃度（c）線性回歸。得拉莫三嗪、奧卡西平標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：Y＝0.5511 c－0.5669（r＝0.9940）、Y＝0.4026 c－0.5895（r＝0.9925）。結(jié)果表明，拉莫三嗪、奧卡西平血藥濃度均在0.5～50 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下工作液，加入適量空白血漿，配成含拉莫三嗪分別為25、10、2 μg/ml和奧卡西平分別為25、10、2 μg/ml的低、中、高3種質(zhì)量濃度血樣。各血樣按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，連續(xù)測(cè)定5批，計(jì)算得3個(gè)濃度血樣中拉莫三嗪的RSD分別為4.01%、6.15%、4.64%，奧卡西平的RSD分別為3.05%、4.27%、9.01%，結(jié)果見表1。

表1 拉莫三嗪和奧卡西平精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1 Results of precision tests of lamotrigine and oxcarbazepine（n＝5）

2.7 回收率試驗(yàn)

精密量取不同濃度的拉莫三嗪、奧卡西平標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μl，置于1.5 ml離心管中，40℃空氣揮干，加入空白血漿0.5 ml，制成高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度（5、25、50 μg/ml）的質(zhì)控樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，將測(cè)得的峰面積與未經(jīng)提取的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積比較，計(jì)算提取回收率，即提取回收率＝A/As×100%。式中A為血漿樣品溶液中藥物的峰面積，As為相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液中藥物的峰面積，結(jié)果見表2。

表2 拉莫三嗪和奧卡西平的提取回收率（n＝5）Tab 2 Extraction recoveries of lamotrigine and oxcarbazepine（n＝5）

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.8.1 常溫穩(wěn)定性：取“2.6”項(xiàng)下低、中、高3種質(zhì)量濃度血樣，分別于室溫放置0、2、4 h后處理測(cè)定，計(jì)算得拉莫三嗪的RSD為2.55%～8.77%，奧卡西平的RSD為3.54%～8.25%。表明血樣于室溫放置4 h穩(wěn)定，結(jié)果見表3。

表3 拉莫三嗪和奧卡西平常溫穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of stability tests of lamotrigine and oxcarbazepine under room temperature（n＝3）

2.8.2 4℃穩(wěn)定性（48 h）：取上述3種濃度血樣，分別于4℃放置0、24、48 h后處理測(cè)定，計(jì)算得拉莫三嗪的RSD為3.02%～5.70%，奧卡西平的RSD為3.42%～5.59%。表明血樣于4℃放置48 h穩(wěn)定，結(jié)果見表4。

表4 拉莫三嗪和奧卡西平4℃穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 4 Results of stability tests of lamotrigine and oxcarbazepine at 4℃（n＝3）

2.8.3 多次凍融試驗(yàn)：取上述3種濃度血樣各3份，于－20℃冷凍保存至少24 h后室溫解凍重復(fù)3次后，處理測(cè)定。結(jié)果拉莫三嗪的RSD為1.49%～6.10%，奧卡西平各濃度的RSD為2.70%～8.22%。表明血漿樣品3次凍融后穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表5。

表5 拉莫三嗪和奧卡西平多次凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 5 Results of stability tests of lamotrigine and oxcarbazepine after repeated freeze-thawing（n＝3）

3 討論

奧卡西平在257 nm波長(zhǎng)處有最大吸收波長(zhǎng)[3]，拉莫三嗪在225 nm波長(zhǎng)處有最大吸收[4]。本法采用了240 nm的波長(zhǎng)，目的是為了兼顧兩者的含量測(cè)定，減少基線的漂移和雜質(zhì)峰的影響。

奧卡西平為卡馬西平的流動(dòng)相為衍生物，理化性質(zhì)相似，且臨床上一般不會(huì)同時(shí)應(yīng)用奧卡西平與卡馬西平，因此本試驗(yàn)首先嘗試用卡馬西平作為內(nèi)標(biāo)。但試驗(yàn)證實(shí)，卡馬西平在本條件下保留時(shí)間約30 min左右，因此不適于作為內(nèi)標(biāo)。有文獻(xiàn)報(bào)道，氯唑沙宗為內(nèi)標(biāo)時(shí)保留時(shí)間在拉莫三嗪和奧卡西平之后[5]，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，保留時(shí)間約18min左右，且分離度良好，因此選用氯唑沙宗為內(nèi)標(biāo)。同時(shí)考慮本條件下奧卡西平與氯唑沙宗保留時(shí)間較接近，若兩者濃度均較大可能會(huì)互相影響，因此將內(nèi)標(biāo)溶液配置為24 μg/ml，按照樣品制備方法進(jìn)樣時(shí)內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為18 μg/ml。

經(jīng)考察在流動(dòng)相為40%甲醇時(shí)樣品分離度良好[6]，但若加入血漿樣品時(shí)拉莫三嗪與內(nèi)源性物質(zhì)產(chǎn)生干擾，因此嘗試在流動(dòng)相中加入酸，從而改變其保留時(shí)間，同時(shí)使峰形得到優(yōu)化。在流動(dòng)相中加入乙酸與磷酸時(shí)均未使拉莫三嗪與內(nèi)源物質(zhì)達(dá)到理想分離度，因此選取0.1%三氟乙酸。此條件下化合物與內(nèi)源物達(dá)到良好分離度，同時(shí)峰形較佳。但此濃度三氟乙酸會(huì)使柱壓上升，經(jīng)考察將三氟乙酸濃度減半，即0.05%三氟乙酸對(duì)柱壓影響較小并可使化合物得到良好分離。

考慮到臨床檢測(cè)血藥濃度會(huì)在同一時(shí)間檢測(cè)多人的血樣，因此選取3個(gè)濃度各5個(gè)平行樣品連續(xù)測(cè)定對(duì)精密度進(jìn)行考察。

臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)工作中經(jīng)常需對(duì)血樣標(biāo)本進(jìn)行保存，以進(jìn)行批量監(jiān)測(cè)。因此，本研究對(duì)常溫穩(wěn)定性、4℃穩(wěn)定性、多次凍融穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，以確定樣品的可存放時(shí)間及存放條件。

隨著HPLC在醫(yī)院的普及，采用HPLC測(cè)定血藥濃度將會(huì)日益廣泛[7]。

拉莫三嗪和奧卡西平在臨床日常應(yīng)用中存在聯(lián)用現(xiàn)象，因此，在臨床檢測(cè)中有時(shí)候會(huì)要求同時(shí)檢測(cè)二者的血藥濃度。有些患者醫(yī)療知識(shí)欠缺，出現(xiàn)中毒癥狀時(shí)說不清究竟自己以往用的是哪種藥品；有些患者在某些不規(guī)范的醫(yī)療機(jī)構(gòu)服用的中藥制劑中摻雜有多種不明化學(xué)成分的藥品，同時(shí)檢測(cè)多種藥物血藥濃度就顯得十分重要[8]。現(xiàn)在三級(jí)醫(yī)院等級(jí)評(píng)審工作中明確要求醫(yī)院開展血藥濃度監(jiān)測(cè)工作，且不會(huì)僅僅限于大醫(yī)院，許多基層醫(yī)院均會(huì)開展血藥濃度監(jiān)測(cè)工作。鑒于這2種藥物尚不能采用熒光偏振免疫分析（TDX）儀等專業(yè)化大型設(shè)備檢測(cè)，增加采用HPLC法的血藥濃度監(jiān)測(cè)項(xiàng)目有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究采用HPLC法，可以同時(shí)測(cè)定拉莫三嗪和奧卡西平血藥濃度。本法操作簡(jiǎn)單、回收率高、精密度好，適用于臨床上單獨(dú)檢測(cè)拉莫三嗪或奧卡西平的血藥濃度，也適于同時(shí)檢測(cè)二者血藥濃度。

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