楊前，高殿文

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科，遼寧 大連11 6023；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院眼科，沈陽(yáng)110004）

腦紅蛋白（neuroglobin，Ngb）是2000年由德國(guó)Burmester等首先發(fā)現(xiàn)的一種攜氧球蛋白，是繼血紅蛋白（Hb）和肌紅蛋白（Mb）之后的第三種攜氧球蛋白［1］。主要在腦組織中表達(dá)，故命名。Ngb能夠可逆性地結(jié)合氧，與氧有很高的親和力，能夠特異性地向腦組織供氧，在神經(jīng)系統(tǒng)氧的攝取、運(yùn)輸和利用等生理過(guò)程中起極其重要的作用。即使血氧濃度較低，與氧具有很高親和力的Ngb仍將促進(jìn)氧向線(xiàn)粒體的擴(kuò)散或直接介導(dǎo)氧向線(xiàn)粒體的傳遞，促進(jìn)ATP的產(chǎn)生，從而維持正常神經(jīng)元的功能［2］。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Ngb可以保護(hù)神經(jīng)元免受缺血缺氧的損害［3，4］。視覺(jué)信息傳導(dǎo)過(guò)程中需要消耗大量的氧氣，因此視網(wǎng)膜是人體耗氧量最大的組織之一。視網(wǎng)膜中Ngb的含量是大腦中的100倍，分布于除色素上皮以外的所有視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)［5］。Ngb與氧結(jié)合的特性，以及Ngb在視網(wǎng)膜的特異性分布為我們進(jìn)行缺血缺氧視網(wǎng)膜疾病的研究帶來(lái)了全新的令人振奮的思路和方向。

本研究旨在構(gòu)建以GFP為報(bào)告基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pAcGFP1-C1-Ngb，并將其轉(zhuǎn)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）中，為進(jìn)一步研究Ngb基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

健康雄性成年SD大鼠1只，體質(zhì)量210 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。質(zhì)粒pAcGFP1-C1購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，大腸桿菌JM109為本室保存。RNAiso Plus、KpnⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、BamHⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、DL-2000 Marker，DNA膠回收試劑盒及RNA PCR Kit（AMV）Ver3.0均購(gòu)自大連寶生物工程公司。LipofectamineTM2000和DMEM培養(yǎng)液為Invitrogen公司產(chǎn)品，胎牛血清購(gòu)于Gibico公司，SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。引物的合成及DNA測(cè)序均由大連寶生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 Ngb基因的PCR擴(kuò)增：將SD大鼠斷頭處死，取出適量的腦組織，按照RNAiso Plus說(shuō)明書(shū)提取總RNA，經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及含量。采用兩步法RT-PCR擴(kuò)增Ngb基因。20 μL反轉(zhuǎn)錄體系包括：1 μL Total RNA，1 μL Oligo dT Primer，1 μL dNTP Mixture，4 μL5× PrimeScript RT Buffer，0.5 μL RNase Inhibitor（40 U/μL），PrimeScript RTase0.5 μL，12 μL 去 RNase水。反應(yīng)條件為：42 ℃，60 min；70℃，15 min。反應(yīng)產(chǎn)物（大鼠cDNA）在-20℃保存。

根據(jù)大鼠Ngb基因的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物：Ngb上游引物：5′-ATAGGTACCATGGAGCGCCTAGAGT CAGA-3′，Ngb 下游引物：5′-AATGGATCCTTACTCC CCGTCCCAGCCTCG-3′以大鼠cDNA為模板，使用Prime STAR?HS DNA Polymerase試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系包括：1 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，10 μL5× Prime STAR Buffer（Mg2+plus），0.5 μLNgb 上游引物（20μmol/L），0.5μLNgb下游引物（20μmol/L），4 μL dNTP Mixture，0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μL），33.5 μL dH2O。反應(yīng)條件為：94℃3 min，98℃10 s→68℃1 min，共30個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析。使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑盒切膠回收上述Ngb基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（456 bp）。經(jīng)BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切后，回收備用。

1.2.2 重組真核表達(dá)載體pAcGFP1-C1-Ngb的構(gòu)建及鑒定：將上述回收純化的Ngb基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取陽(yáng)性菌落提取重組質(zhì)粒pMD19-Ngb。分別使用限制性?xún)?nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ對(duì)pMD19-Ngb及pAcGFP1-C1商品化空載體進(jìn)行雙酶切處理。1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，切膠回收pAcGFP1-C1/KpnⅠ/BamHⅠ線(xiàn)性載體片段和pMD19-Ngb/KpnⅠ/BamHⅠ中的Ngb基因片段，將二者使用DNA連接酶進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取重組表達(dá)質(zhì)粒pAcGFP1-C1-Ngb并進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。

1.2.3 重組真核表達(dá)載體pAcGFP1-C1-Ngb轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞及其表達(dá)：質(zhì)粒DNA的制備：大量提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒pAcGFP1-C1-Ngb，分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算質(zhì)粒濃度，保存?zhèn)溆谩?/p>

神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)：神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（SH-SY5Y）在37℃、5%CO2條件下置于10%胎牛血清的DMEM液中培養(yǎng)。2 d換液1次，2～3 d用消化液常規(guī)消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染的前1 d，將細(xì)胞間隔交叉接種在6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為2×105/孔，培養(yǎng)24 h達(dá)60%～80%融合。

pAcGFP1-C1-Ngb質(zhì)粒的脂轉(zhuǎn)：將SH-SY5Y細(xì)胞分為2組，轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組按照Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集2組細(xì)胞檢測(cè)Ngb蛋白的表達(dá)。

蛋白表達(dá)的檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后48 h，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況。Western blot檢測(cè)2組細(xì)胞Ngb表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 Ngb目的基因的PCR擴(kuò)增

Ngb目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果，于500 bp附近可見(jiàn)一較亮條帶，未見(jiàn)有非特異條帶存在（見(jiàn)圖1）。

2.2 重組真核表達(dá)載體pAcGFP1-C1-Ngb酶切及測(cè)序鑒定結(jié)果

雙酶切產(chǎn)物中Ngb基因片段和線(xiàn)性載體pAcGFP1-C1經(jīng)純化后的電泳鑒定結(jié)果（圖2、圖3）。

2.3 熒光顯微鏡觀察

倒置熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染48 h后，重組質(zhì)粒pAcGFP1-C1-Ngb轉(zhuǎn)染組細(xì)胞發(fā)出綠色熒光（圖4），而空白對(duì)照組無(wú)綠色熒光發(fā)出。

2.4 Western blot結(jié)果

轉(zhuǎn)染組SH-SY5Y細(xì)胞中Ngb蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組細(xì)胞（圖5）。

3 討論

Ngb是Burmester等在人和小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)攜氧球蛋白，由151個(gè)氨基酸組成的單體蛋白，分子量為17 kDa。Ngb具有獨(dú)特的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，Ngb基因缺乏TATA閱讀框。Ngb與血紅蛋白、肌紅蛋白同屬球蛋白家族，但氨基酸序列相似性很小（與血紅蛋白的同源性小于21%，與肌紅蛋白的同源性小于25%），這表明Ngb在進(jìn)化上和功能上具有獨(dú)特性。Ngb主要在腦組織、視網(wǎng)膜及內(nèi)分泌組織中表達(dá)［1］。Ngb能夠可逆地結(jié)合氧，且與氧有很高的親和力，能夠特異性地向神經(jīng)組織供氧［2］。受此啟發(fā)，對(duì)缺血缺氧性視神經(jīng)、視網(wǎng)膜疾病的治療提供了新思路。

為了進(jìn)一步研究Ngb的結(jié)構(gòu)和功能，我們從雄性SD大鼠腦組織中提取總RNA，根據(jù)引物設(shè)計(jì)采用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，經(jīng)測(cè)序分析，獲得其編碼序列為456個(gè)堿基，與基因庫(kù)里的大鼠Ngb編碼區(qū)序列完全一致，沒(méi)有堿基發(fā)生突變。隨后我們將PCR擴(kuò)增的目的片段連接到T載體（TS-Ngb），利用基因重組技術(shù)將TS-Ngb及目的載體pAcGFP1-C1進(jìn)行雙酶切，進(jìn)行連接，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pAcGFP1-C1-Ngb。

質(zhì)粒pAcGFP1-C1是一種真核表達(dá)質(zhì)粒，由GFP報(bào)告基因、SV40啟動(dòng)子、多克隆酶切位點(diǎn)和卡那霉素及新霉素抗性基因等組成。報(bào)告基因GFP是最早從水母中分離出來(lái)，其基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)714 bp，蛋白相對(duì)分子量約26 kDa。用波長(zhǎng)約450～490 nm的藍(lán)光線(xiàn)激發(fā)后發(fā)出綠色熒光，可通過(guò)熒光顯微鏡直接觀測(cè)。GFP無(wú)需任何的作用底物或共作用物。檢測(cè)的靈敏度不受反應(yīng)效率的影響，保證了極高的檢出率。GFP蛋白本身性質(zhì)穩(wěn)定，可在多種異源生物中表達(dá)且無(wú)細(xì)胞毒性。GFP基因片段長(zhǎng)度較小，易于構(gòu)建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發(fā)活性，為研究其他基因表達(dá)產(chǎn)物的分布提供了方便。GFP與其他蛋白的融合表達(dá)已有很多成功的例子，而且其N(xiāo)及C端均可融合，并不影響其發(fā)光。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了GFP與Ngb基因直接嵌合生成的真核表達(dá)載體pAcGFP1-C1-Ngb，以表達(dá)產(chǎn)生融合蛋白，既保留了Ngb蛋白的神經(jīng)保護(hù)活性，又能通過(guò)融合蛋白表達(dá)后仍能保持熒光激發(fā)活性。在后來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，我們將pAcGFP1-C1-Ngb轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞中，倒置熒光顯微鏡下可明顯觀察到細(xì)胞呈綠色熒光，說(shuō)明融合蛋白成功表達(dá)。而對(duì)轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞Westernblot檢測(cè)也進(jìn)一步說(shuō)明Ngb基因已成功插入到真核表達(dá)載體pAcGFP1-C1中，真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究打下了基礎(chǔ)。

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