王燕，胡慧媛，趙美瞇，閔冬雨，聶志偉，孫雪菲，趙金生，印丹丹，郝麗英

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理教研室，沈陽(yáng)110001；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110032；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，沈陽(yáng)110001）

2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）是脂溶性光敏感復(fù)合物，1894年首次合成用來(lái)檢測(cè)種子的生存能力，1958年開(kāi)始用來(lái)染色檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織的缺血梗死［1］。TTC染色因染色后顏色較易觀察且靈敏性高而被廣泛用于研究離體心臟缺血/再灌注損傷中［2］。在TTC染色方法中染料濃度、染色時(shí)間較為明確，TTC濃度大多采用1%［3］和1.5%［4］，染色時(shí)間為10～20 min［5～9］。但是，對(duì)于TTC染色后較為適宜的觀察時(shí)間目前尚無(wú)文章報(bào)道。在結(jié)果分析方面，大多實(shí)驗(yàn)采用全部心臟切片進(jìn)行TTC染色。此法雖可全面評(píng)估缺血/再灌注損傷，但TTC染色后的心臟橫切片無(wú)法再應(yīng)用于Western blot、PCR等后續(xù)實(shí)驗(yàn)中［10］。因此，本研究通過(guò)制作豚鼠離體心臟缺血/再灌注模型，將心臟制成4個(gè)橫切片后進(jìn)行TTC染色，分別于染色后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1、2、3、4周）對(duì)其進(jìn)行逐個(gè)觀察，明確應(yīng)用TTC染色方法評(píng)價(jià)豚鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的適宜觀察時(shí)間；并分別統(tǒng)計(jì)前2片、前3片和前4片的梗死面積百分比，明確是否可采用單個(gè)橫切片染色判斷缺血/再灌注損傷以及如何采用多個(gè)橫切片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)等問(wèn)題，以此建立節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間和動(dòng)物的TTC染色觀察和統(tǒng)計(jì)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

豚鼠11只，雌雄不限，280～420 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。TTC染料（由Amrecro公司提供）；主要配方：Krebs-Henseleit（K-H） 溶液（mmol·L-1）：NaCl116，KCl3.6，CaCl21.2，KH2PO41.16，MgSO40.58，NaHCO323.0，Glucose5.4，Pyruvate0.3，Insulin2.8 U·L-1，pH 7.38～7.42。0.1 mol/L PBS溶液（mmol/L）：NaH2PO419，Na2HPO481，NaCl15.4，以上試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及動(dòng)物模型的制備：11只豚鼠飼養(yǎng)觀察1周后，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，仰臥位固定，剪開(kāi)頸部皮膚，分離頸部肌肉，暴露氣管，穿線，剪開(kāi)氣管，行氣管插管，固定氣管。剪胸部皮毛，分離胸肌，暴露主動(dòng)脈，分離主動(dòng)脈旁結(jié)締組織，主動(dòng)脈插管，插管成功后將心臟離體并置于37℃的保溫槽中行主動(dòng)脈逆行灌注（穩(wěn)定后心率<130次/min者放棄）。灌流溫度控制在（37±0.2）℃，灌注壓為75 cmH2O，并于灌注過(guò)程中持續(xù)通入含95%O2和5%CO2混合氣體。

1.2.2 分組：Langendorff灌流裝置中用正常K-H液灌注心臟，先平衡10 min，穩(wěn)定15 min，對(duì)照組（control組，n=5）繼續(xù)用正常K-H液灌流90 min，缺血/再灌注組（I30R60組，n=6）用止血鉗夾緊灌流管，全心缺血30 min后松開(kāi)止血鉗，正常K-H液再灌注60 min。

1.2.3 TTC染色：灌流結(jié)束后，取下心臟，取刀片垂直心臟長(zhǎng)軸將其橫切為5片，每片約為2 mm。展平后置于PBS（0.1 mol/L）溶解的1%TTC溶液中，37℃避光孵育20 min，取出后置于10%中性甲醛（0.1 mol/L PBS配制）中。分別于染色后第1、2、3、4周對(duì)4個(gè)橫切片的正反兩面進(jìn)行圖像采集，照片采用Photoshop3S Extended軟件計(jì)算梗死面積。梗死面積百分比（%）=梗死面積/橫切片總面積×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 第1周TTC染色結(jié)果

如圖1所示，control組各個(gè)心臟橫切片染色后為磚紅色。I30R60組染色后可見(jiàn)稍淺的白色區(qū)域（圖1箭頭所示），第1、2、3、4橫切片的梗死面積百分比與control組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1，P<0.05）。

2.2 第2周TTC染色結(jié)果

TTC染色后第2周時(shí)，I30R60組白色梗死區(qū)域更為明顯，梗死區(qū)域有所增加（圖2），第1、2、3、4 橫切片的梗死面積百分比與control組比較除第1片外，其余3個(gè)橫切片均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1，P<0.05）。

2.3 第3周TTC染色結(jié)果

如圖3所示，I30R60組染色后可見(jiàn)稍淡的白色區(qū)域，第1、2、3、4橫切片的梗死面積百分比與control組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05，表1）。

2.4 第4周TTC染色結(jié)果（圖4）

TTC染色后4周I30R60組中第4個(gè)橫切片梗死面積百分比，與control組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），其余各橫切片均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05，表1）。

2.5 TTC染色梗死面積計(jì)算方法比較

如表2所示，采用前2橫切片（包括第1片和第2片）計(jì)算梗死面積百分比的結(jié)果顯示，I30R60組第1周和第2周的梗死面積與control組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01，P<0.05），第3周和第4周2組與control組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。前3橫切片（包括第1片、第2片和第3片）計(jì)算結(jié)果可見(jiàn)，I30R60組第1周和第2周的梗死面積百分比與control組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第3周和第4周2組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。前4橫切片（包括第1片、第2片、第3片和第4片）計(jì)算結(jié)果顯示，I30R60組第1周和第2周的梗死面積百分比與control組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第3周和第4周2組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

3 討論

TTC染色法是依據(jù)組織中琥珀酸脫氫酶在二氫煙酰胺腺嘌呤二核苷酸存在條件下，將無(wú)色氧化型TTC還原成紅色還原型TTC，使有活性的組織染色，而壞死組織不著色，即正常心肌染成磚紅色，存活心肌呈淡紅色，梗死心肌由于缺乏完整的脫氫酶系統(tǒng)而不染色［11］。

本研究采用離體心臟的缺血30 min再灌注60 min模型為目前常用模型，結(jié)果表明，缺血組各個(gè)心臟切片隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)I30R60組與對(duì)照組梗死面積百分比差異較小，與對(duì)照組比較，I30R60組第1周各片梗死面積均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第2周第2、3、4片梗死面積有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而第3周各片梗死面積與對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第4周僅第4片梗死面積與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。統(tǒng)計(jì)方面，缺血組無(wú)論采用前2橫切片、前3橫切片或者前4橫切片于第1周、第2周內(nèi)觀察梗死面積與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），而于第3周、第4周觀察均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

本實(shí)驗(yàn)中I30R60組于第3、4周內(nèi)觀察梗死區(qū)域不明顯可能與染色后的心肌長(zhǎng)期貯存于甲醛中使紅色還原型TTC甲月贊（formazan）溶解，所染顏色漸褪后使整個(gè)所染心肌色差降低，無(wú)法判斷梗死區(qū)域相關(guān)，并且也可能與甲醛中心臟橫切片的蛋白發(fā)生交聯(lián)而使TTC染色后的磚紅色區(qū)域褪色或者變白有關(guān)。因?yàn)?0%中性甲醛雖是診斷病理學(xué)中最常用的固定劑，但甲醛水溶液中甲醛能形成亞甲基氫氯化合物，后者能與蛋白質(zhì)的幾個(gè)側(cè)鏈反應(yīng)形成反應(yīng)性羥甲基側(cè)鏈。在中性甲醛中短期貯藏時(shí)，賴氨酸側(cè)鏈上的羥甲基和精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸交聯(lián)從而達(dá)到固定作用；長(zhǎng)期貯藏時(shí)，所形成的反應(yīng)性羥甲基側(cè)鏈可被氧化形成更加穩(wěn)定的反應(yīng)基，從而使大分子變性并使它們不可溶解進(jìn)而出現(xiàn)蛋白交聯(lián)［12］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在利用TTC染色進(jìn)行評(píng)價(jià)豚鼠離體心臟缺血/再灌注損傷實(shí)驗(yàn)時(shí)單個(gè)橫切片或多個(gè)橫切片共同觀察的適宜觀察時(shí)間為第1周和第2周。統(tǒng)計(jì)方法上，可采用第1周或第2周的前2橫切片、前3橫切片，剩余切片可用于Western blot、PCR等后續(xù)實(shí)驗(yàn)中；在實(shí)驗(yàn)時(shí)間和條件允許情況下，亦可使用第1周或第2周的前4橫切片計(jì)算梗死面積百分比。

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