陳文娟，何林李，程順華，楊光參，王艷偉

（溫州大學(xué) 物理與電子信息工程學(xué)院，浙江 溫州325035）

1 引 言

動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（Dynamic light scattering，DLS）是一種建立在顆粒動(dòng)力學(xué)信息與其發(fā)出的散射光的漲落關(guān)系上的方法，能有效測(cè)量亞微米和納米級(jí)顆粒粒度［1］.自從Cummins等人在1964年首次成功將DLS應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究中后，人們陸續(xù)將目光投注在DLS上，DLS技術(shù)得到不斷補(bǔ)充完善并發(fā)展為成熟的測(cè)量技術(shù).在當(dāng)前現(xiàn)有的顆粒粒度檢測(cè)技術(shù)中，DLS技術(shù)具有準(zhǔn)確、快速、可重復(fù)性好、檢測(cè)時(shí)間短、成本低、對(duì)樣品量要求很小等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于顆粒測(cè)量、生物工程、藥物學(xué)以及微生物等領(lǐng)域，尤其在高分子與生物大分子的溶液特性、分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)狀態(tài)及生物大分子的凝聚等領(lǐng)域顯示了廣泛的應(yīng)用前景［2-4］.

原子力顯微鏡（AFM）克服了掃描隧道顯微鏡（STM）對(duì)樣品要求的限制，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍［5］.AFM利用微懸臂上的探針做力傳感器，針尖與樣品之間作用力的變化使懸臂震動(dòng)，導(dǎo)致射到懸臂上面的激光的反射光發(fā)生偏轉(zhuǎn)，探測(cè)器將偏轉(zhuǎn)量記錄下轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，在控制器做信號(hào)處理轉(zhuǎn)換成樣品形貌圖像，AFM在各研究領(lǐng)域特別是生物大分子（DNA、蛋白）及特性（DNA凝聚等）研究中得到廣泛應(yīng)用.

DNA凝聚是1個(gè)或者幾個(gè)DNA分子由自由伸展?fàn)顟B(tài)坍縮到更加緊湊的有序結(jié)構(gòu)的過程.導(dǎo)致DNA凝聚的凝聚劑有很多，比如三價(jià)或者更高價(jià)的離子、陽離子多肽、組蛋白、乙醇等［6］.DNA凝聚在DNA包裝成染色質(zhì)的過程有很廣泛的生物應(yīng)用性，是基因傳輸與轉(zhuǎn)錄中重要的運(yùn)輸工具［7-9］.一般認(rèn)為，多價(jià)離子導(dǎo)致DNA凝聚的凝聚機(jī)制是多價(jià)離子中和了DNA磷酸根的負(fù)電荷，從而使DNA片段的排斥力減小，靜電吸引力增強(qiáng)，引起DNA鏈的坍縮，從而形成更加緊湊的結(jié)構(gòu).物理學(xué)家研究DNA性質(zhì)及DNA與凝聚劑的作用機(jī)制的的重要研究手段有DLS技術(shù)［10］及 AFM 技術(shù)［11］等，通過測(cè)量其凝聚后粒徑的大小及凝聚的形態(tài)變化來分析凝聚劑與DNA的相互作用機(jī)制及凝聚過程的粒徑分布模式等.

我們?cè)诮F(xiàn)代物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)中用DLS及AFM技術(shù)測(cè)量DNA與凝聚劑相互作用后粒徑大小及凝聚過程形態(tài)變化和分布模式等為設(shè)計(jì)內(nèi)容，開設(shè)了綜合設(shè)計(jì)型研究前沿實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中所用樣品，可由學(xué)生自己動(dòng)手準(zhǔn)備，這不但有助于學(xué)生熟悉、掌握基礎(chǔ)的樣品準(zhǔn)備方法，還能更好地掌握DLS及AFM技術(shù)的基本原理和應(yīng)用.

2 實(shí)驗(yàn)原理

2.1 DLS的實(shí)驗(yàn)原理

DLS是測(cè)量光強(qiáng)隨時(shí)間起伏變化規(guī)律的手段，如果納米粒子在溶液中處于無規(guī)則的布朗運(yùn)動(dòng)，這種無規(guī)則的運(yùn)動(dòng)使散射光強(qiáng)度在時(shí)間上表現(xiàn)為平均光強(qiáng)附近的隨機(jī)漲落，它是由各個(gè)散射粒子發(fā)出的散射光場(chǎng)相干疊加而成的.懸浮液中的顆粒由于受到了周圍做布朗運(yùn)動(dòng)分子的不斷撞擊，而不停地進(jìn)行隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，在激光的照射下，運(yùn)動(dòng)顆粒的散射光強(qiáng)也將產(chǎn)生隨機(jī)的波動(dòng)，而且波動(dòng)的頻率與顆粒的大小有關(guān)，在一定角度下，顆粒越小，漲落越快.通過計(jì)算漲落變化的時(shí)域自相關(guān)函數(shù)，就可以得到影響變化的顆粒粒徑信息.因此，DLS法也稱為光子相關(guān)光譜法［12］.

當(dāng)一束單色平行光照射溶液樣品時(shí)，遇到做布朗運(yùn)動(dòng)的球形粒子，產(chǎn)生散射光，散射光強(qiáng)隨時(shí)間漲落，顆粒運(yùn)動(dòng)的速度越快，散射光強(qiáng)變化就越快，光強(qiáng)的自相關(guān)函數(shù)為

其中，A 為光強(qiáng)自相關(guān)函數(shù)G（2）（τ）的基線，β為約束信噪比常量，A和β都與實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)，Γ為瑞利線寬.除了布朗運(yùn)動(dòng)能夠?qū)е律⑸涔鈴?qiáng)隨時(shí)間漲落外，其他如環(huán)境等因素也能夠影響顆粒散射光強(qiáng)的漲落.在存在布朗運(yùn)動(dòng)為唯一因素時(shí)，

式中，D為顆粒的平移擴(kuò)散系數(shù)，q為散射光波矢的幅值，q＝sin，其中n為溶劑折射率，θ為散射角，λ0為入射光在真空中波長(zhǎng).如果樣品顆粒為球形，則根據(jù)Stokes-Einstein理論可以得到D的計(jì)算公式為

其中kB為玻爾茲量常量，T為絕為溫度，η為溶液黏度，d為粒子直徑.通過（3）式可以計(jì)算出被測(cè)樣品顆粒的粒徑.

2.2 AFM的實(shí)驗(yàn)原理

在AFM的系統(tǒng)中，使用微小懸臂來感測(cè)針尖與樣品之間的相互作用，此作用力會(huì)使微懸臂擺動(dòng)，當(dāng)擺動(dòng)形成時(shí)，會(huì)使照在懸臂末端的激光的反射光位置改變而造成偏移量，激光檢測(cè)器會(huì)記錄此偏移量，也會(huì)把此時(shí)的信號(hào)傳給反饋系統(tǒng)，以利于系統(tǒng)做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，最后再將樣品的表面特性以影像的方式呈現(xiàn)［13］.

原子力顯微鏡與樣品間的相互作用以范德華力為主，其作用勢(shì)能一般用Lennard-Jones勢(shì)能函數(shù)表示：

式中，r是兩原子的核間距，δ是勢(shì)能為0時(shí)原子核間距，ε是勢(shì)阱深度，是勢(shì)能曲線上最低點(diǎn)勢(shì)能的絕對(duì)值.當(dāng)懸臂尖端的原子與樣品靠近，開始時(shí)吸引力起主導(dǎo)作用，隨著距離的減小，二者之間的吸引力與排斥力將趨于平衡，當(dāng)兩原子進(jìn)一步靠近時(shí)，范德華力以斥力為主.

3 實(shí)驗(yàn)材料與方法

3.1 DLS實(shí)驗(yàn)的材料與方法

實(shí)驗(yàn)選用的λ-DNA購(gòu)于New England Biolabs公司，原始濃度為500mg／L，保存液為1×TE緩沖液（10mmol／L Tris-HCl和 1mmol／L EDTA，pH＝8.0）.用于配置樣品的超純水是由美國(guó)Millipore公司超純水系統(tǒng)處理生產(chǎn)的.凝聚劑三氯六氨絡(luò)合鈷購(gòu)買于Sigma公司，使用時(shí)用超純水稀釋，最終濃度分別為1，2.5，5，7.5，10，15μmol／L.最后樣品中λ-DNA 的最終濃度為1mg／L.

DLS實(shí)驗(yàn)使用的儀器為英國(guó)馬爾文的Zetasizer Nano-ZS90.由 He-Ne激光器（波長(zhǎng)為632.8nm）發(fā)出的光入射到裝有DNA與鈷離子混合溶液的矩形高純度石英樣品池，在散射角為90°的方向用探測(cè)器接收散射光，散射光經(jīng)信號(hào)數(shù)字相關(guān)器處理后最終被送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和計(jì)算.實(shí)驗(yàn)條件：樣品室內(nèi)溫度25℃，溶劑水的折射率n＝1.330，水的黏度η＝0.887 2mPa·s.樣品采樣持續(xù)時(shí)間為300s.實(shí)驗(yàn)結(jié)果用給定的軟件Zetasizer Nano-ZS90software輸出.

3.2 AFM實(shí)驗(yàn)的材料與方法

λ-DNA及超純水的來源同上，λ-DNA的最終濃度也為1mg／L.云母片切割成邊長(zhǎng)為1cm的正方形，用雙面膠粘在圓形鐵片上，利用其作為襯底制備樣品.凝聚劑三氯六氨絡(luò)合鈷用超純水稀釋，最終濃度分別為30，60，100，150μmol／L.AFM型號(hào)為島津公司的SPM-9600，探針購(gòu)買自Nanoworld，懸臂彈性系數(shù)為42N／m，共振頻率為320kHz.模式采用氣態(tài)的輕敲模式，圖像采集的掃描頻率為2Hz，像素為512×512.圖片使用時(shí)經(jīng)過平滑去噪處理以提高對(duì)比度.

實(shí)驗(yàn)過程首先用超純水把鈷離子稀釋到預(yù)計(jì)濃度，混合均勻后加入DNA，使DNA的最終濃度為1mg／L.用移液器取約15μL稀釋的DNA溶液，滴在新解理的云母片上面，沉積3min，然后用約200μL純水沖洗，氮?dú)獯蹈?，放入干燥?h以上，待掃描.

4 結(jié)果與討論

4.1 DLS的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

在DLS實(shí)驗(yàn)過程中通過改變樣品的培育時(shí)間與Co（NH3）3＋6的濃度來觀察DNA與多價(jià)離子相互作用后粒徑的改變情況.由于多價(jià)離子能夠使DNA發(fā)生凝聚，所以混合后的粒徑就會(huì)變小，具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過給定的軟件輸出，直接給出樣品的半徑，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，其中每個(gè)粒徑（半徑）為5次測(cè)量的平均值，每次測(cè)量值都是儀器顯示的統(tǒng)計(jì)平均的最終結(jié)果，分析模式采用單峰的分析模式，而且有一定的峰寬.所有數(shù)據(jù)的測(cè)量不確定度為±3nm.

表1 粒徑測(cè)量數(shù)據(jù)

圖1 不同樣品培育時(shí)間的Co（NH3）3＋6粒徑-濃度曲線

圖2 不同Co（NH3）3＋6 濃度的粒徑-培育時(shí)間曲線

由圖1可以看出培育時(shí)間為15min時(shí)，增大Co（NH3）3＋6濃度，測(cè)得的λ-DNA粒徑會(huì)慢慢減小，然后趨于穩(wěn)定.再進(jìn)一步增加培育時(shí)間為30min時(shí)，λ-DNA 的粒徑隨著 Co（NH3）3＋6濃度的增加會(huì)相對(duì)較快地趨于穩(wěn)定.當(dāng)培育時(shí)間為120min時(shí)，隨著Co（NH3）3＋6濃度的增加，λ-DNA的粒徑幾乎不會(huì)發(fā)生太大改變，而是與Co（NH3）3＋6濃度很小時(shí)的粒徑相似，只有很小的變化.通過3條曲線對(duì)比可知，培育時(shí)間120min后，DNA幾乎處于凝聚狀態(tài)，粒徑已經(jīng)變化不大.由圖1的結(jié)果可知Co（NH3）3＋6導(dǎo)致的DNA凝聚過程需要一定的反應(yīng)時(shí)間，作用過程中Co（NH3）3＋6逐漸與DNA磷酸基上的負(fù)電荷進(jìn)行中和，這個(gè)過程并不是極短時(shí)間內(nèi)完成的.所以樣品培育時(shí)間越長(zhǎng)，DNA鏈上負(fù)電荷被中和越多，DNA凝聚就越嚴(yán)重，當(dāng)培育時(shí)間達(dá)120min時(shí)，DNA在很低的Co（NH3）3＋6濃度下，就會(huì)處于凝聚狀態(tài)，所以DNA的粒徑隨著培育時(shí)間的再增加不會(huì)發(fā)生大改變.而且在粒徑的分析時(shí)采用單峰的分布模式進(jìn)行處理，即認(rèn)為在同一個(gè)多價(jià)離子濃度下，如果樣品混合均勻、操作正確，所有DNA從自由舒展構(gòu)象到凝聚構(gòu)象變化中處于同一過程，當(dāng)然有個(gè)別情況構(gòu)象不相同，這就要考慮單峰分布模式有一定峰寬.實(shí)驗(yàn)中取單峰分布情況的數(shù)據(jù)，最后統(tǒng)計(jì)平均最終粒徑結(jié)果.

從圖2中可以看出，Co（NH3）3＋6濃度低于7.5μmol／L時(shí)，不同培育時(shí)間測(cè)得的λ-DNA粒徑相差較大，DNA粒徑隨著培育時(shí)間的增加而慢慢減小，在培育60min后，都會(huì)慢慢趨于穩(wěn)定.當(dāng)Co（NH3）3＋6濃度提升到大于等于7.5μmol／L時(shí)，不同培育時(shí)間的λ-DNA粒徑的差距較小，曲線開始靠近，DNA粒徑相差不大，在培育時(shí)間很短的情況下粒徑就幾乎達(dá)到33nm.可見培育時(shí)間作為影響λ-DNA凝聚的一個(gè)因素外，凝聚劑的濃度也是影響DNA凝聚的重要因素.高濃度的凝聚劑能夠促使磷酸基上的負(fù)電荷更快地被中和，所以達(dá)到穩(wěn)定的最小粒徑需要更少時(shí)間.

4.2 AFM的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

在AFM實(shí)驗(yàn)中，取了培育時(shí)間為30min的4個(gè)鈷離子濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，直接觀察多價(jià)離子與DNA作用后凝聚形態(tài)的變化情況，如圖3所示，可見鈷離子導(dǎo)致DNA凝聚的最終形態(tài)一般是花一樣的構(gòu)象.

由圖3可以看出：隨著鈷離子濃度的增加，DNA的凝聚越來越嚴(yán)重.此部分實(shí)驗(yàn)與DLS比較導(dǎo)致DNA凝聚的鈷離子濃度要偏大，因?yàn)樵贏FM實(shí)驗(yàn)中云母表面帶負(fù)電也會(huì)中和多價(jià)離子，所以多價(jià)離子必須一部分被吸附在云母表面，其余部分才用來凝聚DNA，那么導(dǎo)致DNA凝聚的離子濃度就要更大才有效果.而且用AFM的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明DLS中粒徑的分析采用單峰的分布模式是正確的，也就是說DNA從松散構(gòu)象到凝聚構(gòu)象轉(zhuǎn)化過程中一般所有的DNA都處于同一形態(tài)，如圖3所示.也有個(gè)別情況構(gòu)象不同，如圖3（a），可以看見沒有凝聚的自由舒展的DNA，原因可能是操作過程中水沖或者氮?dú)獯邓鶎?dǎo)致，但是基本構(gòu)象不會(huì)相差很大，即單峰的分析模式還是要考慮一定的峰寬，前面的DLS實(shí)驗(yàn)結(jié)果就是采用單峰分析模式的最終統(tǒng)計(jì)平均結(jié)果，一般樣品分布均勻，操作規(guī)范，不會(huì)出現(xiàn)同一凝聚劑濃度下一部分處于全松散，一部分處于高度凝聚狀態(tài)的情況.

在多價(jià)陽離子與DNA作用的過程中，Co（NH3）3＋6只有在中和DNA磷酸骨架負(fù)電荷達(dá)到89%以上才能引起DNA凝聚.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明該過程受凝聚劑濃度和樣品培育時(shí)間等因素的影響，結(jié)果用DLS技術(shù)得到充分的證明.多價(jià)離子導(dǎo)致的DNA凝聚過程是快速而且同步的過程，即結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變是在同一時(shí)間、同一濃度下基本一致.AFM的圖像直觀地顯示出這一現(xiàn)象.當(dāng)然使用DLS及AFM技術(shù)進(jìn)行粒度測(cè)量和形態(tài)的測(cè)量時(shí)不可避免地受到噪聲影響，最終測(cè)得的顆粒粒徑和形態(tài)都存在一定的噪聲誤差.如樣品池的使用，樣品的均勻混合度、環(huán)境溫度的控制和儀器的事先預(yù)熱及實(shí)驗(yàn)的操作等都不可避免地引起實(shí)驗(yàn)的誤差，在實(shí)驗(yàn)過程中都要引起注意.

圖3 不同Co（NH3）3＋6濃度下DNA凝聚的AFM圖像

5 結(jié)束語

用DLS及AFM技術(shù)探究Co（NH3）3＋6誘導(dǎo)DNA凝聚過程中粒徑變化和凝聚形態(tài)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明影響DNA凝聚的因素有樣品的培育時(shí)間和凝聚劑的濃度等.該方法在醫(yī)學(xué)、海洋生物學(xué)、物理、化學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域已得到深入應(yīng)用.將該實(shí)驗(yàn)引入近代物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，可以提高學(xué)生的動(dòng)手能力和綜合分析能力，同時(shí)有助于拓寬學(xué)生的知識(shí)層面，提升學(xué)生對(duì)物理學(xué)和生物學(xué)交匯領(lǐng)域的認(rèn)知.

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