耿果霞，李雪濤，石美虹，李青旺*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100)

隨著豬人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用，精液保存技術(shù)越來越受到重視。豬精液常溫保存4～6 d，基本上能達(dá)到正常受胎率和產(chǎn)仔水平[1]。精清中含有抑制精子代謝的物質(zhì)，較低程度的稀釋可以促進(jìn)精子的運(yùn)動，而較高程度的稀釋導(dǎo)致精子喪失運(yùn)動能力、代謝活性和受精能力下降[2]。豬新鮮精液pH為7.2～7.5，低于豬精液pH的環(huán)境能降低豬精子的代謝和運(yùn)動水平，延長精液的存活時間[3-5]。郭洪杞等[6]與Kuster 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，保持稀釋液的pH在5.5～6.5之間，稀釋后精液pH就會維持在6.5～7.0之間，對延長精子壽命有顯著效果[7]。何蘭花等[8]研究認(rèn)為，pH為6.4是豬精液保存最佳值。因此，弱酸環(huán)境被認(rèn)為是精液保存的理想環(huán)境。但戈新等[9]認(rèn)為，精液在保存過程中會產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，堿性稀釋液能中和一部分酸性物質(zhì)，防止稀釋液過酸造成精子死亡[10]。因此，稀釋液的pH沒有統(tǒng)一的結(jié)論。除稀釋液pH對豬精液的影響外，稀釋液中添加一定量的緩沖劑可以中和精子的代謝產(chǎn)物，防止過酸化導(dǎo)致精子死亡，維持精液pH的動態(tài)平衡，同樣可以起到保護(hù)精子的作用，如檸檬酸鈉、磷酸鹽類、Tris以及HEPES等[10]。本研究通過檢測弱酸環(huán)境下不同pH的精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整率來反映精子的保存效果，從而確定用于保存豬精液的稀釋液pH，為豬精液的常溫保存提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

新鮮公豬精液(采集自武功縣山佳生態(tài)種豬場健康種豬)儀器：臺式冷凍離心機(jī)；超凈工作臺；普通冰箱；倒置顯微鏡；實(shí)驗(yàn)室用pH計；水浴鍋；電子天平；數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱；超純水儀等。試劑：BTS稀釋液、檸檬酸鹽精子低滲液、0.01 mol/L鹽酸溶液、甲醛固定液、姬姆薩染色液。

1.2 方 法

1.2.1 稀釋液 取7個10 mL離心管并編號,每個離心管中加入配制好的貝茲維爾解凍液(Beltsville thawing solution，BTS)2 mL，用0.01 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)BTS稀釋液的pH，使1～6號管的對應(yīng)pH分別為6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7，7號管為對照組，pH為7.2。完成后保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 精液的稀釋與保存 將檢查合格的70 mL精液分裝為7份，在15 ℃下低速(800×g)離心15 min，棄去上清，將1～7號離心管中的BTS稀釋液加入，混勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中，17 ℃保存。

1.3 精液品質(zhì)測定

1.3.1 精子活率的測定 從17 ℃恒溫箱中取出保存的精液，用移液槍吸取10 μL置于載玻片上，蓋上蓋玻片后立即在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察[11]。每個樣品隨機(jī)觀察5個視野，每次數(shù)200個精子，檢測直線前進(jìn)運(yùn)動的精子數(shù)占總精子數(shù)的比例，計算精子活率。

精子活率=(直線前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)/精子總數(shù))×100%

1.3.2 精子質(zhì)膜完整性 從17 ℃恒溫箱中取出保存的精液，用移液槍吸取10 μL置于載玻片上，用預(yù)熱至37 ℃的檸檬酸鹽低滲液混勻孵育30 min，蓋上蓋玻片后在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察[12]。每個樣品隨機(jī)觀察5個視野，每次數(shù)200個精子，計算精子質(zhì)膜完整率。

精子質(zhì)膜完整率=(彎尾精子數(shù)/精子總數(shù))×100%

1.3.3 精子頂體完整性 從17 ℃恒溫箱中取出保存的精液，用移液槍吸取20 μL置于載玻片上，制成抹片后在空氣中干燥，甲醛固定15 min后緩慢的用雙蒸水沖洗，干燥后均勻滴加姬姆薩染色液，使其全部覆蓋，染色1.5 h后緩慢的用雙蒸水沖洗，置于空氣中干燥，在400倍倒置顯微鏡下觀察[11]。每個樣品隨機(jī)觀察5個視野，每次數(shù)200個精子，計算精子頂體完整率。

精子頂體完整率=(頂體完整精子數(shù)/精子總數(shù))×100%

1.4 統(tǒng)計分析

整個試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，所有試驗(yàn)樣品每隔8 h進(jìn)行一次品質(zhì)測定，共測定7次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件處理，試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH稀釋液對豬精子活率的影響

用不同pH稀釋液稀釋后的精液每隔8 h進(jìn)行一次精子活率測定，測定結(jié)果如表1所示。

表1 0～48 h中不同弱酸性環(huán)境下的精子活率Table 1 The sperm motility rate in weak acid environment with different pH after diluted 0～48 h %

注：同行肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: In the same row, different superscripts mean significant difference (P<0.05).The same below.

精液在剛經(jīng)過稀釋后的活率無顯著性差異(P>0.05)，24 h后精子活率明顯下降,其中用pH為6.4和6.5的稀釋液稀釋的精液精子活率最高，且分別高于對照組15.17%和14.82%(P<0.05)。48 h后，用pH為6.2、6.3和6.7的稀釋液的精子活率明顯降低，而pH為6.4的稀釋液保存的精子活率仍高于對照組18.34%(P<0.05)。72 h后觀察精子全部死亡。

2.2 不同pH稀釋液對精子質(zhì)膜完整性的影響

通過每隔8 h對用不同pH稀釋液稀釋后的精子質(zhì)膜完整性測定，精液在剛經(jīng)過稀釋后質(zhì)膜完整性無顯著性差異(P>0.05)，表明在剛進(jìn)行處理后的精液還未受到影響(表2)。24 h后，精子質(zhì)膜完整性明顯下降，其中用pH為6.4和6.5的稀釋液稀釋的精液精子質(zhì)膜完整率較高，分別比對照組高7.34%和12.34%(P<0.05)。48h后，pH為6.5的稀釋液保存的精子質(zhì)膜完整性最好，達(dá)到42.17%，比對照組高19.36%(P<0.05)。pH為6.4的稀釋液中的精子質(zhì)膜完整率略低，pH為6.5的低6.65%；而pH6.2的稀釋液中的精子質(zhì)膜完整性最差，比對照組低3.13%。

2.3 不同pH稀釋液對精子頂體完整性的影響

用不同pH稀釋液稀釋后的精液每隔8 h進(jìn)行精子頂體完整性測定結(jié)果如表3。精液在剛經(jīng)過稀釋后，頂體完整性無顯著性差異(P>0.05)，說明未處理前初始條件相同。24 h后觀察精子頂體完整性出現(xiàn)明顯下降，其中用pH為6.4和6.5的稀釋液稀釋的精液精子頂體完整率較高，分別比對照組高出16.18%%和14.18%(P<0.05)。48 h后，pH為6.2、6.6、6.7的稀釋液保存的精子頂體完整率較低。pH為6.4和6.5的稀釋液稀釋的精液精子頂體完整率仍較高，分別高出對照組19.02%和18.83%(P<0.05)。72 h后觀察精子頂體完整性都降至為0。

表2 0～48 h中不同弱酸性環(huán)境下的精子質(zhì)膜完整性Table 2 The sperm plasma membrane integrity in weak acid environment with different pH after diluted 0～48 h %

表3 0～48 h中不同弱酸性環(huán)境下的精子頂體完整性Table 3 The sperm acrosome integrity in weak acid environment with different pH after diluted 0～48 h %

3 討 論

關(guān)于稀釋液的pH對豬新鮮精液的保存的影響，國內(nèi)外仍然不是十分清楚。一些研究認(rèn)為當(dāng)豬新鮮精液pH為7.2～7.5時，通過降低豬精子的代謝和運(yùn)動水平，可延長精子的存活時間[3-5]。郭洪杞等[6]與Kuster等[4]研究揭示，豬精液pH維持在6.5～7.0之間，有利于延長精子存活時間[7]。何蘭花等[8]研究發(fā)現(xiàn)，豬精液pH為6.4時保存效果較好。因此，豬精液保存在弱酸環(huán)境條件下被認(rèn)為是較為理想的環(huán)境。在本試驗(yàn)中，通過檢測不同pH的弱酸性環(huán)境下的稀釋液保存的常溫豬精液品質(zhì)，表明pH為6.4的稀釋液精子活率較高， pH為6.5的稀釋液的精子質(zhì)膜完整性較高，而pH 6.4和6.5環(huán)境下的精子頂體完整性均較高。這一結(jié)果與何蘭花等[8]的研究結(jié)果較為一致，表明豬精液稀釋液pH對豬常溫精液保存具有明顯的影響作用。但是在pH 6.4到6.5之間適宜精子保存的弱酸性環(huán)境稀釋液的更適宜的范圍仍有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

不同pH的弱酸性環(huán)境稀釋液對豬精液常溫保存具有明顯的影響，而pH為6.4和6.5的弱酸環(huán)境稀釋液常溫保存豬精液效果在24 h內(nèi)較好。

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