吳 健 劉紅芝 張 芳 付燕燕 王淑玲 宋遠見

(1.徐州醫(yī)學院，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)學院 附屬市立醫(yī)院，江蘇 徐州221000)

0 引言

Akt信號通路調控細胞增殖和生長，參與細胞凋亡及糖代謝過程，是細胞信號轉導網絡的重要樞鈕之一。Akt1信號通路是腫瘤細胞中最活躍的通路之一，Akt1基因在多種腫瘤組織中存在過表達[1]。探討Akt1基因的功能對于研究細胞凋亡及腫瘤發(fā)生和發(fā)展具有重要意義，Akt1基因的體外合成和構建真核細胞基因表達質?？梢詾锳kt1基因功能及相關疾病的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Pfu DNA polymerase購自生工生物工程（上海）有限公司，瓊脂糖和DNA凝膠回收試劑盒（離心柱型）均購自天根生化科技（北京）有限公司，DNA內切酶、DNA連接酶和DNA marker均購自MBI Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 用PCR方法對大鼠Akt1序列進行基因合成

1）oligo設計合成，目的基因上下游分別加上NheI和BamHI及保護堿基，用于基因合成后的亞克隆。

2）oligo合成。

3）將oligo溶解成50μM，將oligo分別取相同體積至1.5ml離心管，混合均勻，配成oligo mix。

4）用配制好的oligo mix進行第一輪PCR反應，循環(huán)條件：95℃3min 1 cycle；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec 30 cycles；72℃ 5min 1 cycle。

5）第二輪PCR反應，模板為第一輪PCR反應的產物。反應條件與第一輪相同。第一輪PCR可得到混有目的基因條帶的非單一條帶PCR產物混合物，再用第一輪的PCR產物為模板，通過第二輪PCR則可獲得單一的目的基因條帶。

6）電泳，回收大鼠Akt1基因片段。

1.2.2 大鼠Akt1克隆到pGCMV/MCS/RFP/Neo中并用酶切法驗證

1）用NheI和BamHI對大鼠Akt1基因的片段進行酶切，37℃酶切2小時；

2）用 NheI和 BamHI對 pGCMV/MCS/RFP/Neo進行酶切，37℃酶切2小時；

3）電泳，用DNA凝膠回收試劑盒回收雙酶切的大鼠Akt1基因片段和載體pGCMV/MCS/RFP/Neo；

4）用T4 DNA ligase連接雙酶切得到的大鼠Akt1基因片段和線性化的載體，22℃連接2小時；

5）取10μl連接產物轉化100μl感受態(tài)細胞Top10，均勻涂布于50μg/ml Ampicillin平板，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約16小時；

6）挑取陽性克隆抽提質粒，用酶切法驗證。

2 結果

大鼠Akt1 PCR電泳圖片如圖1所示。

大鼠Akt1-pGCMV/MCS/RFP/Neo重組質粒NheI和BamHI雙酶切鑒定圖片如圖2。

圖1 大鼠Akt1 PCR電泳1.大鼠 Akt1 PCR；2.marker MBI SM0331；3.marker MBI SM0331.

圖2 大鼠Akt1-pGCMV/MCS/RFP/Neo重組質粒NheI和BamHI雙酶切鑒定4.重組質粒 NheI和 BamHI雙酶切；5.marker MBI SM0331.

3 討論

蛋白激酶B(Akt)是絲／蘇氨酸激酶家族成員，是細胞信號傳導的重要樞鈕之一。Akt的功能復雜多樣，其底物迄今已發(fā)現(xiàn)有50余種蛋白[2]。 哺乳動物基因組中有三種 Akt，即 Akt1、Akt2，Akt3，在腦中 Akt1的含量最高，其活性的下降與腦缺血損傷后神經細胞的凋亡相關[3]。Akt參與細胞增殖和凋亡等多方面的調節(jié)，是細胞生長的調控中樞。Akt是原癌基因，細胞內的P13K可促進Akt的激活，后者再激活mTOR，從而調控細胞周期，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的信號傳導過程中發(fā)揮重要作用。在肝癌、胃癌、血癌、胰腺癌等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號通路的活化[4]。

體外合成Akt1基因并構建真核細胞基因表達載體可用于該基因相關功能和機制的研究，從而為腦缺血損傷、腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面提供重要基礎。

［1］黃秀蘭，崔國輝，周克元，等.PI3K-Akt信號通路與腫瘤細胞凋亡關系的研究進展[J].癌癥，2008，27（03）：331-336.

［2］AyraI-Kaloustian S,Gu J,Lucas J,et a1.Hybrid inhibitors of phosphotedylinositol 3-kinase(PI3K)and the mammalian target of rapamycin(mTOR):design,synthesis,and superiorantitumoractivity ofnovelwortmannin-rapamycin conjugates[J].Med Chem，2010，53（01）： 452-459.

［3］劉革修.腦缺血損傷與 Akt研究的進展[J].中國臨床康復，2005，9（21）：167-169.

［4］Missiaglia E,Dalai I,Barbi S,et al.Pancreatic endocrine tumors:expression profiling evidences a role for Akt-mTOR pathway[J].J Clin Oncol，2010，28（02）：245-255.